佐太對柔紅霉素的增效作用

張 婷， 賈雯靖， 岳會蘭， 畢齊茂， 周國英， 趙曉輝*

(1.中國科學院西北高原生物研究所，青海 西寧 810008；2.中國科學院大學，北京 100049)

佐太又稱為“甘露精王”，是藏醫藥的核心制劑和典型代表，是由水銀添加各種輔助藥物后經過特殊復雜工藝加工炮制而得的一種具有獨特作用的藍黑色粉末制劑，主要成分為硫化汞[1-3]。藏醫藥理論認為，佐太在復方藥物中具有增強諸藥療效的作用，是配制珍寶類藥物必不可少的佐輔劑[4-5]，許多知名的藏藥復方中都含有佐太，如七十味珍珠丸、仁青常覺、仁青芒覺等[1,4,6]，相關制劑在治療中風、麻痹病、高血壓、神經系統疾病、心血管障礙、肝膽胃腸疾病、腫瘤等疾病時往往能發揮獨特的功效[3,6-7]。

隨著安全性研究的不斷深入，初步證實佐太在正常臨床劑量下對機體毒性甚微，但關于其在復方藥物中的增效作用一直以來缺少數據支持[8-10]，究其原因，一方面是藏藥復方藥物成份復雜，另一方面是藏藥都是綜合施治，很難確定目標成分，而且缺少相應的藥理模型對其增效作用開展研究。因此，本研究選用抗癌單體藥物柔紅霉素作為研究對象，考察佐太促進其進入癌細胞內部及促凋亡效果，以期為闡明該藏藥的增效作用提供參考。

1 材料

1.1 細胞株 人慢性髓原白血病細胞株 K562、人喉鱗癌細胞株HN4，均購自武漢普諾賽生命科技有限公司；人肝癌細胞株HepG2，購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 動物 SPF級雌性BALB/c無胸腺裸鼠，4～6周齡，體質量(20±2) g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK(京)2014-0004，于中國科學院西北高原生物研究所動物實驗中心SPF級環境下飼養。動物實驗程序嚴格按照國家衛生研究所實驗動物護理和使用指南開展，并經中國科學院西北高原生物研究所實驗動物倫理委員會批準。

1.3 藥物與試劑 柔紅霉素(上海海正輝瑞制藥有限公司，批號18005711)；佐太(青海久美藏藥藥業有限公司)。二甲基亞砜(天津百世化工有限公司，批號20161010)；甲醇(山東禹王和天下新材料有限公司，批號20181103026)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，批號18110505)；RPMI 1640細胞培養基、DMEM/F-12 1∶1細胞培養基、DMEM細胞培養基、胰酶消化液(美國Gibco公司，批號分別為2091763、8119160、30819011、1974026)；PBS緩沖液(武漢博士德生物工程有限公司，批號14F12B21)；MTT 試劑盒、Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，批號分別為C0009、082319190826)。

1.4 儀器 DM11型倒置顯微鏡(德國Leica公司)；BE-9010型微孔板恒溫振蕩器(浙江賽德儀器設備有限公司)；Epoch2型微孔板分光光度計(美國BioTek公司)；5430R型高速冷凍離心機(德國 Eppendorf 公司)；FACSMelody流式細胞儀(美國BD公司)；RV10型旋轉蒸發儀(美國IKA公司)；Agilent 1260-6470液質聯用儀(上海安捷倫科技有限公司)；INCO108 CO2培養箱(德國Memmert公司)；XM-100T超聲波破碎機(上海凈信實業發展有限公司)；749540-0000微量電動勻漿器(美國Kimble公司)。

2 方法

2.1 佐太促進柔紅霉素在癌細胞內部的富集研究(HPLC-MS分析)

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取柔紅霉素對照品1 mg，加入甲醇制成1 mg/mL溶液，即得。

2.1.2 給藥與樣品采集 稱取適量柔紅霉素、佐太，加入3種對應細胞所需培養基，配成1 mg/mL溶液備用。取對數生長期的K562、HN4、HepG2細胞，按3×105個/mL濃度接種于6孔板中，于24、48、72 h給藥，每個時間段分為柔紅霉素(2.0 μmol/L)給藥組、佐太(5 ng/mL)聯合柔紅霉素(2.0 μmol/L)給藥組，適量胰酶消化細胞并轉移至離心管中，加入PBS緩沖液，2 000 r/min離心5 min，吸棄上清，清洗3次除去胞外藥物，沉淀中再加入500 μL PBS，充分混勻后細胞計數，以3×105個/mL濃度收取細胞，加入100 μL甲醇，超聲波破碎機充分裂解后加入甲醇至終體積1.5 mL，超聲提取30 min，有機膜過濾至離心管中待分析。

2.1.3 色譜條件 流動相甲醇-水(含0.1%甲酸)(7∶3)；體積流量0.2 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量5 μL。

2.1.4 質譜條件 Agilent1260-6470 三重四級桿液質聯用儀分析，電噴霧離子源(ESI)，正離子模式；多重反應選擇離子檢測(MRM)；離子噴霧電壓4 000 V，霧化溫度400 ℃；柔紅霉素監測離子對m/z528.4～321.2。

2.2 佐太體外增效作用研究

2.2.1 溶液制備 將柔紅霉素和佐太溶于DMSO(<0.05%)中，加入對應培養基制成 2 mmol/L溶液備用。

2.2.2 細胞培養 將K562、HepG2、HN4細胞分別培養于含10%胎牛血清和1%青霉素、1%鏈霉素的RPMI 1640培養基、DMEM培養基和DMEM/F-12培養基中，置于37 ℃、含5% CO2的培養箱中培養，待細胞生長至培養皿的70%～80%時進行傳代，生長至對數期時進行實驗。

2.2.3 MTT法 取對數生長期的K562、HN4、HepG2細胞，以5×103個/孔接種于96孔培養板中，每孔200 μL，每組設6個復孔，培養24 h后棄上清，分別給予柔紅霉素或柔紅霉素+佐太，設置空白組(培養基)、對照組(細胞+培養基)、佐太給藥組、柔紅霉素給藥組、佐太聯合柔紅霉素給藥組，HN4、K562組每孔加入不同濃度柔紅霉素(處理48 h給藥濃度為4.0、8.0、16.0 μmol/L，處理72 h為2.0、4.0、8.0 μmol/L)或聯合5 ng/mL佐太給藥，HepG2組每孔加入不同濃度柔紅霉素(處理48 h給藥濃度為2.0、4.0、8.0 μmol/L，處理72 h為1.0、2.0、4.0 μmol/L)或聯合5 ng/mL佐太給藥，培養48、72 h后吸棄上清，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，4 h后吸棄上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩器混勻，用酶標儀分別檢測490、570 nm處各孔OD值，計算細胞存活率，公式為存活率=[(給藥組OD-空白組OD)/(對照組OD-空白組OD)]×100%，重復3次，取平均值。

2.2.4 Annexin V-FITC/PI 染實驗 取對數生長期K562、HN4、HepG2細胞，按3×105個/mL濃度接種于6孔板中，分為對照組、柔紅霉素(2 μmol/L)給藥組、佐太(5 ng/mL)聯合柔紅霉素(2.0 μmol/L)給藥組，培養72 h后收集細胞，用預冷的PBS緩沖液重懸細胞3次，離心，吸棄上清，重懸于195 μL結合液，加入5 μL Annexin V-FITC 溶液、10 μL PI溶液，輕輕吹打混勻，避光孵育15 min，轉移至流式管中，加入1 mL PBS，流式細胞儀測定細胞凋亡率。

2.2.5 給藥 4 ～ 6周齡雌性BALB/c無胸腺裸鼠于SPF級動物房飼養，12 h光照，小腹右側皮下注射1×106～ 2×106個K562細胞進行腫瘤移植，2周后待腫瘤組織較明顯、直徑大約在2 mm時隨機分為4組，每組10只小鼠，荷瘤小鼠腹腔注射給藥，分別設置空白對照組、柔紅霉素給藥組、佐太聯合柔紅霉素給藥組，柔紅霉素、佐太給藥劑量分別為2.5 mg/kg、0.2 μg/kg，每隔1 d給藥1次，同時測定腫瘤體積[體積=(寬度)2×長度/2]。給藥3周后取小鼠腫瘤組織，稱定質量。

3 結果

3.1 佐太促進柔紅霉素進入不同癌細胞內部實現藥物富集 與單獨給藥組比較，聯合給藥組在給藥48、72 h后K562和HepG2細胞內部柔紅霉素水平分別提高(94.0±46.1)%、(50.7±11.8)%和(93.6±9.8)%、(40.0±17.9)%，但在HN4細胞中給藥24、48 h后呈現一定的抑制作用，而給藥72 h后胞內藥物濃度提高(120.3±12.0)%，高于單獨給藥組，見圖1。

注：與空白組 (2.0 μmol/L柔紅霉素) 比較，*P<0.05，**P<0.01。圖1 佐太對柔紅霉素進入不同癌細胞后的促進作用

3.2 佐太對柔紅霉素促癌細胞凋亡的影響 給藥48 h后，柔紅霉素對HN4、K562、HepG2的IC50分別為(7.20±0.52)、(8.65±0.45)、(4.62±0.68)μmol/L，給藥72 h后分別為(6.10±0.25)、(5.63±0.36)、(2.83±0.61)μmol/L，而佐太對其IC50均大于40 μg/mL，而本實驗中選擇5 ng/mL佐太，對三者均無抑制作用。圖2顯示，佐太聯合柔紅霉素給藥48、72 h后能增加后者促凋亡效果，其中48 h后能使低劑量給藥組對HN4、K562、HepG2細胞的作用效果分別提高1.42%、8.56%、7.56%，72 h后分別提高10.35%、8.70%、8.33%；佐太在中、低劑量組具有增效作用，而在高劑量組作用不明顯，可能是高劑量下單獨給藥組、聯合給藥組凋亡率都較高，掩蓋了佐太增效作用。Annexin-V FITC/PI雙染實驗結果見圖3，可知佐太能增加柔紅霉素對3種癌細胞的促凋亡效果。

注: 與柔紅霉素組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖2 佐太對柔紅霉素促癌細胞凋亡的增效作用(MTT法)

注：與柔紅霉素組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖3 佐太對柔紅霉素藥物促癌細胞凋亡的增效作用(流式細胞術)

3.3 佐太對柔紅霉素抑制K562移植瘤生長的增效作用 給藥3周后，單獨給藥組、聯合給藥組均能抑制小鼠腫瘤生長，其中聯合給藥組小鼠整體狀態、活躍度、體質量更優，腫瘤體積有所減小但無明顯差異，聯合給藥組瘤體質量也有所降低。圖4～5顯示，聯合給藥組抑制腫瘤增長的作用優于單獨給藥組，表明佐太在體內也具有一定的增效作用。

注: A～C分別為空白對照組、單獨給藥組、聯合給藥組。圖4 BALB/c裸鼠移植瘤模型及各組裸鼠腫瘤體積

注: 與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與柔紅霉素組比較，#P<0.05。圖5 佐太對柔紅霉素抑制K562移植瘤生長的增效作用

4 討論

中醫藥中利用重金屬類制劑治療疾病歷史悠久，其中朱砂、雄黃及砒霜最為知名[11-12]。而藏醫藥中則以佐太為最典型代表，且目前仍廣泛使用，在臨床用藥中發揮著不可替代的作用[6]。這些重金屬類制劑在中華民族醫療史中占據著重要的地位，同時在保障人民生命健康方面也發揮了重要作用。但在中醫藥的發展過程中，這些含汞、砷類重金屬制劑也不斷的因為毒性問題而受到質疑甚至禁用。但隨著毒理學研究的不斷深入，重金屬制劑藥用劑量的安全性問題已經逐步得到科學解釋。而且隨著As2O3聯合反式維甲酸在治療急性早幼粒白血病方面獲得成功，使得民族醫藥中重金屬制劑的現代應用值得研究和期待[13]。

佐太是藏醫藥中配制珍寶類復方藥物不可缺少的關鍵成分，在藏醫藥體系及臨床治療中占據著重要地位[6,14]。 “十一五”和“十二五”期間多個研究單位已經對佐太的安全性進行了全面評價，證實在臨床劑量下和臨床服藥周期內對機體無不良作用[9-10]。但佐太在復方藥物中增強諸藥療效的作用及其機制仍缺少實驗研究和數據支撐。

本研究以抗癌單體藥物柔紅霉素為研究對象，證實佐太在體外能夠促進藥物進入癌細胞內部實現藥物富集，對藥物的增量可以達到40% 以上。同時，能夠增加柔紅霉素對HN4、K562和HepG2三種癌細胞的促凋亡作用，說明佐太能夠通過促進藥物吸收達到促進癌細胞凋亡實現增效的作用。體內實驗同樣證實，佐太能夠提高柔紅霉素對K562移植瘤生長的抑制作用。

通過研究證實，佐太能夠促進單體藥物的吸收進而實現增效作用。但它的增效作用機制仍需進一步深入研究。佐太中的主要成份為HgS，這種重金屬成份是否以刺激劑或者以載體的形式促進藥物吸收，這些問題都需要進一步的實驗研究去驗證。