基于生物信息學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究獨活寄生湯治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的分子機(jī)制

管世兵， 陳春燕， 涂 楚， 陸忠杰*

(1.六安市中醫(yī)院藥劑科，安徽 六安 237006；2.六安市中醫(yī)院心病科，安徽 六安 237006)

絕經(jīng)后會造成女性卵巢肺功能衰退，體內(nèi)雌性激素水平顯著下降，導(dǎo)致谷歌效應(yīng)障礙最終誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生[1]。研究表明，此類患者多以骨量減少，骨脆度增加，外界輕微外力可引發(fā)骨折，嚴(yán)重的影響了患者的生活質(zhì)量[2]。因此，通過積極探尋有效藥物治療顯得尤為關(guān)鍵。獨活寄生湯出自《備急千金要方》，長期應(yīng)用骨關(guān)節(jié)炎治療，能夠有效緩解膝關(guān)節(jié)炎臨床癥狀[3]。新進(jìn)研究發(fā)現(xiàn)，獨活寄生湯也能夠改善骨質(zhì)疏松癥患者臨床癥狀，提高患者的生活質(zhì)量[4]。但是目前有關(guān)獨活寄生湯對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)的作用機(jī)制尚不清楚。因此本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)手段探究獨活寄生湯對PMOP的分子作用機(jī)制，為臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級雌性SD大鼠30只，6～8周齡，由安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供,動物生產(chǎn)許可證號 SCXK(皖)2017-001，飼養(yǎng)條件相對濕度50%～70%，12 h/12 h交替光照，實驗期間均正常飲食飲水。

1.1.2 試劑與藥物 獨活寄生湯購于安徽中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，由獨活(9 g)、桑寄生(6 g)、牛膝(6 g)、杜仲(6 g)、秦艽(6 g)、防風(fēng)(6 g)、肉桂(6 g)、細(xì)辛(6 g)、川芎(6 g)、當(dāng)歸(6 g)、芍藥(6 g)、干地黃(6 g)、人參(6 g)、茯苓(6 g)、甘草(6 g)組成，生藥量為2.269 g/mL；BCA試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司)；caspase-3抗體、Bcl-2(美國CST公司)；p53、p21抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；GAPDH抗體、一抗、二抗稀釋液(江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.1.3 儀器 雙能X射線骨密度儀小動物專用掃描和分析軟件(美國Hologic公司)；MTS-858miniBionix生物材料力學(xué)試驗機(jī)(美國MTS公司)；凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 獨活寄生湯活性化合物成分篩選和靶點預(yù)測 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP)中檢索獨活寄生湯各味中藥的所有化合物成分，并根據(jù)成分毒物動力學(xué)(absorption and distribution and metabolism and excretion，ADME)參數(shù)進(jìn)一步對潛在有效化合物進(jìn)行篩選，篩選條件為：口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，藥物相似性(drug-likeness，DL)≥0.18。利用TCMSP數(shù)據(jù)庫中靶點預(yù)測模型預(yù)測所篩選出化合物的潛在作用靶點。

1.2.2 GEO芯片數(shù)據(jù)分析PMOP相關(guān)靶點 本研究從Gene Expression Omnibus數(shù)據(jù)庫中下載編號為“GSE56116”的芯片數(shù)據(jù)，該芯片數(shù)據(jù)的原始文件將10例絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者作為觀察組，另取3例健康絕經(jīng)后女性作為對照組，對所有患者的基因表達(dá)譜進(jìn)行測序，并尋找兩組間基因表達(dá)差異。所有血液樣本全部采用“GPL4133”平臺進(jìn)行檢測。本研究采用R語言及l(fā)imma等軟件包對基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，默認(rèn)參數(shù)設(shè)置來鑒別相關(guān)差異表達(dá)基因，以 log FC與P值為篩選條件，篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log FC|>1、P<0.05，所篩選出的基因被視為顯著差異表達(dá)基因。

1.2.3 獨活寄生湯治療關(guān)鍵靶點篩選及其蛋白質(zhì)相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 采用Perl語言腳本對篩選出的獨活寄生湯活性成分潛在靶點和PMOP相關(guān)靶點取交集，得到共同靶點；采用Cytoscape 3.7.2軟件中的BisoGenet插件繪制上述靶點的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在網(wǎng)絡(luò)圖形中用“節(jié)點”(node)表示化合物分子，“邊”(edge)表示化合物分子與靶點之間的關(guān)系；最后采用Cyot NCA插件進(jìn)一步對調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觥?/p>

1.2.4 基因本體(GO) 功能分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG) 通路富集分析 本研究采用R語言及相關(guān)功能程序包進(jìn)行GO和KEGG分析。對上述獨活寄生湯活性成分靶點和SARS-CoV感染性肺炎相關(guān)靶點取交集后，將所得的靶點進(jìn)行ID轉(zhuǎn)換，即使用R語言將靶點轉(zhuǎn)化為可識別的entrez ID；在R語言中調(diào)用相關(guān)生物類程序包，如clusterProfiler、BiocManager、enrichplot等進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；調(diào)用R語言中數(shù)據(jù)可視化程序包，如ggplot等繪制GO和KEGG富集分析的條形圖。

1.2.5 分組、造模及給藥 雌性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組和獨活寄生湯組，每組各10只。模型組和獨活寄生湯組大鼠采用背側(cè)入路雙側(cè)卵巢切除法造模，假手術(shù)組切除雙側(cè)卵巢旁脂肪組織，手術(shù)后7 d，期間對大鼠采用青霉素肌肉注射，預(yù)防切口感染。獨活寄生湯組大鼠按照10 mL/(kg·d)劑量進(jìn)行灌胃，實驗組根據(jù)“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”換算，按照9.3 g/(kg·d)劑量進(jìn)行灌胃，連續(xù)治療12周。手術(shù)后12周，3組大鼠進(jìn)行腰椎骨密度檢測。

1.2.6 骨密度檢測 大鼠麻醉后取仰臥位，采用雙能X射線對大鼠全身進(jìn)行掃描，設(shè)定腰椎為感興趣區(qū)域，最后通過儀器相關(guān)軟件進(jìn)行腰椎骨密度分析。

1.2.7 大鼠骨生物力學(xué)檢測 實驗檢測前12 h，從冷凍冰箱內(nèi)取出L4椎體，去除椎間盤、附件、終板，利用砂紙打磨椎體上下兩端以保證兩面的水平，放置于室溫條件下解凍，MTS法進(jìn)行腰椎壓縮實驗。根據(jù)實驗儀器相關(guān)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析得到各組大鼠腰椎剛度和最大載荷。

1.2.8 Western blot實驗 (1)取大鼠脛骨近端骨組織約150 mg，剪碎后放置于1.5 mL的組織研磨管內(nèi)并按照1∶2～1∶3比例加入組織裂解液放置在已經(jīng)預(yù)冷后的組織勻漿儀中進(jìn)行研磨；(2)高速離心機(jī)4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集骨組織上清液，采用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度定量檢測；(3)按照每孔上樣量為30 μg進(jìn)行蛋白質(zhì)凝膠電泳實驗，電泳轉(zhuǎn)膜后牛奶封閉時間約2 h，孵育對應(yīng)caspase-3(1∶1 000)、Bcl-2(1∶2 000)、p53(1∶500)、p21(1∶500)和GAPDH一抗(1∶1 000)4 ℃過夜，孵育二抗(1∶5 000)1 h，于搖床搖晃洗膜，含吐溫磷酸鹽緩沖液洗滌后加入發(fā)光聚合物，使用膠片曝光，圖片掃描后用 Image J 軟件計算各條帶的灰度值，以各目標(biāo)條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 獨活寄生湯活性成分篩選、ADME分析及靶點預(yù)測 通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫，共計檢索獨活寄生湯中茯苓、甘草、秦艽、白頭翁、大棗、黃連、杜仲、川牛膝、熟地、秦皮、赤芍、黃芩、黃柏、黨參、人參、干姜、防風(fēng)、白術(shù)、獨活、桑寄生、半夏、川芎、當(dāng)歸、細(xì)辛24味中藥共計2 733種相關(guān)成分及其ADME參數(shù)。根據(jù)OB、DL參數(shù)共篩選出符合標(biāo)準(zhǔn)的活性成分334個，見圖1。獨活寄生湯中各味中藥活性成分OB≥30%、DL≥0.18的比例見圖2。利用TCMSP數(shù)據(jù)庫靶點預(yù)測技術(shù)對上述活性成分進(jìn)行作用靶點預(yù)測，排除重復(fù)的后共獲得潛在作用靶點313個。

圖1 符合OB≥30%、DL≥0.18篩選標(biāo)準(zhǔn)的化合物數(shù)量

圖2 各味中藥活性成分符合OB≥30%、DL≥0.18的比例

2.2 PMOP相關(guān)靶點基因及其差異分析 進(jìn)一步挖掘GSE56116芯片數(shù)據(jù)原始文件中的相關(guān)數(shù)據(jù)，共獲取健康受試者、PMOP患者間明顯改變的基因共971個，其中在PMOP患者中表達(dá)上調(diào)的541個，表達(dá)下調(diào)的430個，差異基因表達(dá)熱圖、火山圖見圖3～4。

圖3 差異表達(dá)基因熱圖

圖4 差異基因表達(dá)火山圖

2.3 獨活寄生湯治療PMOP的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將“2.1”項下獲得的獨活寄生湯有效成分潛在作用靶點與“2.2”項下獲得的PMOP相關(guān)差異基因靶點取交集共得到獨活寄生湯治療PMOP關(guān)鍵靶點19個。采用Cytoscape軟件建立獨活寄生湯中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，如圖2所示，共獲得134個節(jié)點和157個關(guān)系，半夏中的MOL002714，藿香中的MOL005916、甘草中的MOL004835及柴胡、款冬花、甘草、藿香、麻黃及紫菀中的共有成分MOL000098等有效成分與網(wǎng)絡(luò)中的多個靶點存在相互作用，而GSK3B、NCOA1及CA2等靶點也能作用于多個有效成分，見圖5。

圖5 獨活寄生湯治療PMOP的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

為進(jìn)一步獲得更多節(jié)點的傳遞信息和更高的節(jié)點信息傳遞效率，本研究采用Cytoscape軟件中的BiosGenet和CytoNCA插件，于DIP、BIOGRID、HPRD、INTACT、MINT和BIND數(shù)據(jù)庫種建立獨活寄生湯治療PMOP的19個關(guān)鍵靶點的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，并對網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的拓?fù)鋵傩赃M(jìn)行了分析篩選，共發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵節(jié)點161個，篩選策略示意圖見圖6。

圖6 獨活寄生湯關(guān)鍵節(jié)點的目標(biāo)帥選策略圖

2.4 GO、KEGG富集分析 利用R軟件及相關(guān)程序包對獨活寄生湯治療PMOP的19個鍵靶點進(jìn)行GO和KEGG富集分析，將GO富集過程中的分子生物學(xué)過程、分子功能及細(xì)胞成分和KEGG通路按照P值升序排列，分別取前20、25位進(jìn)行分析，若未滿20或25個則全部納入分析，結(jié)果見圖7～8和表1。由圖7可知，獨活寄生湯治療PMOP關(guān)鍵靶點涉及的生物學(xué)過程主要包括response to xenobiotic stimulus、xenobiotic metabolic process、sterol metabolic process等，分子功能主要包括glutathione binding、oligopeptide binding、cofactor binding等，細(xì)胞成分主要包括intercellular bridge、sarcoplasmic reticulum、sarcoplasm等；由表1、圖8可知，獨活寄生湯治療PMOP的主要信號通路包括Fluid shear stress and atherosclerosis(hsa05418)、Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450(hsa00980)、Leishmaniasis(hsa05140)等，而GSTM1、GSTM2、CCND1、CD40LG、IL4、FOS是各通路主要的富集基因。

注：柱狀圖長度代表基因富集個數(shù)，顏色深度代表P值。圖7 獨活寄生湯治療PMOP的GO富集柱狀圖

圖8 獨活寄生湯治療PMOP的KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

表1 獨活寄生湯治療PMOP的KEGG分析

2.5 獨活寄生湯對大鼠骨密度和生物學(xué)力的影響 表2顯示，獨活寄生湯灌胃處理12周后，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠骨密度、剛度、最大載荷均降低(P<0.01)；與模型組比較，獨活寄生湯組大鼠骨密度、剛度和最大載荷均升高(P<0.05，P<0.01)。

表2 獨活寄生湯對大鼠骨密度和生物學(xué)力的影響

2.6 獨活寄生湯對p53信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)影響 圖9～10顯示，P53信號通路相關(guān)蛋白主要涉及p53、p21以及相關(guān)凋亡蛋白(caspase-3和Bcl-2)；與假手術(shù)組比較，模型組caspase-3表達(dá)升高(P<0.01)，Bcl-2表達(dá)降低(P<0.01)，p53和p21蛋白表達(dá)均升高(P<0.01)；與模型組比較，獨活寄生湯藥物干預(yù)組caspase-3表達(dá)降低(P<0.01)，Bcl-2表達(dá)升高(P<0.05)，p53和p21蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)。

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖9 獨活寄生湯對caspase-3、Bcl-2表達(dá)的影響

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05。圖10 獨活寄生湯對p53、p21表達(dá)的影響

3 討論

獨活寄生湯是由獨活、桑寄生、牛膝、杜仲、秦艽、防風(fēng)、肉桂、細(xì)辛、川芎、當(dāng)歸、芍藥、干地黃、人參、茯苓、甘草組成。其中方劑中的獨活具有祛下焦風(fēng)寒濕邪，為君藥。秦艽、防風(fēng)祛風(fēng)勝濕；肉桂溫里祛寒，通利血脈；細(xì)辛祛寒止痛，均為臣藥。桑寄生、牛膝、杜仲、芍藥補(bǔ)益肝腎，強(qiáng)壯筋骨；甘草調(diào)和諸藥，為使藥。諸藥合用，祛邪扶正，標(biāo)本兼顧，達(dá)到祛風(fēng)濕、止痹痛、益肝腎、補(bǔ)氣血之功效。當(dāng)歸、川芎、干地黃養(yǎng)血活血；人參、茯苓、甘草補(bǔ)氣健脾，扶助正氣，均為佐藥[5-7]。既往研究發(fā)現(xiàn)獨活寄生湯能夠通過調(diào)控骨保護(hù)蛋白以及核因子-κB受體活化自配體和核因子-κB受體活化因子，從而調(diào)節(jié)骨吸收和骨重建等[8-9]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松是女性絕經(jīng)后的一種常見性骨骼疾病，是一種以骨密度低、骨組織微結(jié)構(gòu)損傷，導(dǎo)致的骨脆性增加，最終易于發(fā)生骨折為特點的全身性骨病[10]。臨床試驗研究表明，獨活寄生湯能夠一定程度上改善骨質(zhì)疏松患者的臨床癥狀增加骨密度[11]。但是目前有關(guān)于獨活寄生湯對PMOP的分子作用機(jī)制尚不完全清楚。因此，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與生物信息學(xué)聯(lián)合篩查獨活寄生湯對PMOP的分子作用機(jī)制。

通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫，共計檢索獨活寄生湯中茯苓、甘草、秦艽、白頭翁、大棗、黃連、杜仲、川牛膝、熟地、秦皮、赤芍、黃芩、黃柏、黨參、人參、干姜、防風(fēng)、白術(shù)、獨活、桑寄生、半夏、川芎、當(dāng)歸、細(xì)辛24味中藥并按照獨活寄生湯中各味中藥活性成分OB≥30%和DL≥0.18篩選得到有效活性化合物334中，涉及相關(guān)靶基因313個。進(jìn)一步，通過生物信息學(xué)和GeneCards篩選得到PMOP患者差異表達(dá)基因971個，上調(diào)的基因541個，表達(dá)下調(diào)的基因430個。將獨活寄生湯涉及相關(guān)基因與PMOP有關(guān)基因取交集得到19個可能參與獨活寄生湯治療PMOP。最后對相關(guān)基因與有效活性化合物進(jìn)行Cytoscape軟件處理得到134個節(jié)點和157條邊。以上篩查結(jié)果表明，獨活寄生湯治療PMOP具有多成分多靶點的特點。最后，通過GO功能和KEGG通絡(luò)富集分析得到獨活寄生湯治療PMOP的主要信號通路包括Fluid shear stress and atherosclerosis(hsa05418)、Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450、p53signaling pathway等，而GSTM1、GSTM2、CCND1、CD40LG、IL-4及 FOS是各通路主要的富集基因。p53信號通路廣泛涉及細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)過程。其中p53 是一種抑癌基因，其在細(xì)胞衰老中發(fā)揮重要作用。研究證實，p53能夠通過作用細(xì)胞有絲分裂進(jìn)而影響p53和p21基因，激活相關(guān)基因表達(dá)，最終引起細(xì)胞復(fù)制性衰老[12-15]。細(xì)胞凋亡是機(jī)體的一種正常生理學(xué)過程，其是以caspase-3活化繼而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡小體形成最終被吞噬細(xì)胞吞噬處理[16]。以往研究均已證實，棕櫚酸能夠通過活化p53/p21信號誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞衰老，同時上調(diào)caspase-3，下調(diào)Bcl-2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加，導(dǎo)致肌少癥[17-18]。另外研究表明，在骨質(zhì)疏松癥大鼠模型中，p53和p21表達(dá)均顯著上調(diào)，給予槲皮素后能夠調(diào)控p53/p21途徑，抑制骨細(xì)胞樣細(xì)胞衰老，挽救雌激素缺乏導(dǎo)致的骨丟失[19]。以上研究均表明，p53信號通路在骨質(zhì)疏松癥中發(fā)揮重要作用。因此，本研究通過構(gòu)建PMOP大鼠模型探究獨活寄生湯能否通過p53信號途徑改善PMOP。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠骨密度、剛度和最大載荷均降低。與模型組比較，給予獨活寄生湯能夠升高骨密度、剛度和最大載荷。以上研究結(jié)果表明，獨活寄生湯能夠改善PMOP。為進(jìn)一步探究相關(guān)分子作用機(jī)制，通過Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白以及p53和p21表達(dá)。與假手術(shù)組比較，模型組caspase-3表達(dá)升高，Bcl-2表達(dá)降低，p53和p21蛋白表達(dá)均升高。與模型組比較，獨活寄生湯藥物干預(yù)組caspase-3表達(dá)降低，Bcl-2表達(dá)升高，p53和p21蛋白表達(dá)均降低。

綜上所述，獨活寄生湯治療PMOP具有多成分多靶點特性，其可能通過p53信號通路抑制細(xì)胞凋亡和衰老改善PMOP臨床癥狀。以上研究為獨活寄生湯治療PMOP提供了新的理論依據(jù)。