不同粒徑朱砂對秀麗隱桿線蟲的毒性作用

李丹清， 金司儀， 胡 倩， 李 靜， 曹 艷

(湖北中醫藥大學藥學院，省部共建中藥資源和中藥復方教育部重點實驗室，湖北 武漢 430065)

朱砂為硫化物類礦物辰砂族辰砂，主要成分為硫化汞(HgS)，多為內服，也可外用[1-2]，主要功效為鎮驚安神、解毒明目，可用于治療心悸易驚、失眠多夢、小兒驚風、視物昏花和瘡瘍腫毒等癥[3]。2020年版《中國藥典》中收載含朱砂的中成藥占中藥成方制劑總數的10%左右，不少兒科成方中也含有朱砂[4]。朱砂因含有大量的重金屬汞，使其安全性倍受爭議，近年來因服用朱砂而引起的不良反應或中毒事件也時有發生[5]，《中國藥典》曾先后2次大幅度下調朱砂的用量。朱砂常規炮制方法為水飛，該法既可使藥物粉碎到合適的粒徑又可降低毒性。有研究資料表明，藥物粉碎至較小粒徑時，有利于有效成分的溶出，但也可能會使毒性成分溶出增加。尤其是微米級顆粒粉碎至納米級時，毒性可顯著增強[6-7]。

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans，C.elegans)是一種多細胞真核生物，具有生命周期短暫、體型小、結構簡單、可操作性強、易于在實驗室培養等特點，其全基因組已知，近年來被廣泛用于毒理學方面的研究[8-10]。線蟲的毒性評價指標有眾多：壽命、死亡率和細胞凋亡是研究衰老與毒性的基本手段；運動行為、AChE活性、學習行為和記憶行為主要用于研究神經毒性；生長發育和生殖能力指標主要用于研究發育和生殖方面的毒性[11]。本研究以秀麗隱桿線蟲作為模型，從壽命、運動行為、生長發育、生殖能力、細胞凋亡、ROS水平、AChE活性和化學趨向性等方面研究微米級朱砂(WZ)與納米級朱砂(NZ)對線蟲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試藥品 朱砂取自湖北中醫藥大學標本館。2′，7′-二氯熒光素二乙酸酯(上海源葉生物科技有限公司)。BCA蛋白定量檢測試劑盒和AChE活性測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。無水乙醇、氯化鈉、氫氧化鈉和次氯酸鈉等化學藥品均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器 MS2000馬爾文激光粒度儀、Zetersizer Nano ZS納米粒度、Zeta電位及分子量分析儀(英國馬爾文儀器公司)；體視顯微鏡(南京江南永新光學有限公司)；IX73型熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；MM400冷凍混合球磨儀(德國Retsch公司)；424R小型臺式高速冷凍離心機[艾本德(中國)有限公司]；WaterPurifier，SC083696超純水機(沃特爾水處理設備有限公司)。

1.2 線蟲培養與同步化 實驗用秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans，野生型N2)及缺陷型大腸桿菌(E.coliOP50)均由華中農業大學動科院胡敏教授惠贈。將涂布有大腸桿菌的線蟲生長培養基(NGM)37 ℃過夜培養，待NGM冷卻后，將線蟲置于NGM上，20 ℃恒溫培養。用新鮮配制的線蟲裂解液(1% NaClO和1 mol/L NaOH)裂解懷卵成蟲，得到蟲卵，培養48 h后，對生長至L4期線蟲進行暴露。

1.3 材料處理和暴露方法

1.3.1 材料處理 將朱砂研磨處理后，過300目標準篩，得到微米級朱砂(馬爾文粒度分析儀測得其粒徑分布D10為1.21 μm，D50為10.72 μm，D90為21.36 μm)。將朱砂球磨儀處理60 min，得到納米級朱砂[納米粒度和Zeta電位及分子量分析儀測定其粒徑Z-Average為(458.3+30)nm]。下文中均分別用WZ、NZ指代微米級朱砂和納米級朱砂。

1.3.2 暴露方法 用M9緩沖液將WZ和NZ配制成一定質量濃度的懸濁液，加入到每個培養皿中，等M9緩沖液揮發或者浸入到NGM后，WZ和NZ沉積下來，均勻分散在NGM表層[12]。WZ和NZ采用的質量濃度均為1 μg/cm2和5 μg/cm2，空白對照組在NGM中加入相應體積的M9。暴露前24 h將WZ和NZ注入培養皿中。

1.4 運動行為試驗

1.4.1 身體彎曲頻率 線蟲暴露48 h后，將其轉至不含OP50的NGM板中恢復1 min，每組10條，對20 s內線蟲身體彎曲的次數進行計數。線蟲相對于其身體長軸方向1個波長的運動記為1次身體彎曲。

1.4.2 頭部擺動頻率 線蟲暴露48 h后，于不含OP50的NGM板上滴加一滴M9溶液，將線蟲置于M9中恢復1 min后，再觀察1 min內線蟲頭部擺動次數，每組10條。線蟲頭部從一側擺到另一側再擺回來記為1次頭部擺動。

1.5 生長發育試驗 將給藥暴露后的線蟲挑至滴加有M9的2%瓊脂片上，每組10條，再滴加0.4% NaN3溶液，待蟲體麻醉后，置于熒光倒置顯微鏡下拍照并測量線蟲體長。

1.6 生殖行為試驗 將暴露后線蟲挑至不同組別的NGM板上，每板1條，每24 h將其轉入新的NGM中，直至排卵期結束。含卵板均在20 ℃孵育48 h后再計數，各板后代數相加即為該線蟲總后代數，每組約10條線蟲。

1.7 細胞凋亡測定 將暴露后線蟲挑至含5 μg/mL吖啶橙(AO)染液和OP50的M9溶液中，于20 ℃染色1 h，吸出染色線蟲，于含OP50的NGM板中恢復45 min，全程注意避光。將線蟲挑至含2滴0.2% NaN3溶液的2%瓊脂載玻片上，熒光顯微鏡(激發波長485 nm，發射波長530 nm)下觀察拍照[13]，并用Image Pro Plus 6.0軟件分析各照片熒光強度，每組約10條線蟲。

1.8 活性氧自由基ROS測定 將暴露后線蟲挑至含50 μL M9的無菌96孔板中，隨后加入50 μL H2DCF-DA，至其終濃度為50 μmol/L，于20 ℃處理3 h后，將線蟲轉至滴加0.2% NaN3溶液的2%瓊脂載玻片上，熒光顯微鏡(激發波長485 nm，發射波長530 nm)下觀察拍照[14]，并用Image Pro Plus 6.0軟件分析各照片熒光強度，每組約10條線蟲。

1.9 乙酰膽堿酯酶活性測定 將暴露后的線蟲用M9緩沖液洗下，每組約1 000條線蟲，在冰水浴下超聲破碎，離心，上清液分別用BCA蛋白定量檢測試劑盒和AChE活性測定試劑盒測定總蛋白質量濃度和AChE活性。

1.10 感知行為試驗 線蟲暴露48 h后，用M9洗3次后將其放置于9 cm平板的中心，每組約100條線蟲。在距平板邊緣0.5 cm的一點(a點)滴加乙醇稀釋的0.5%苯甲醛1 μL，并滴加l mol/L疊氮化鈉1 μL(使運動到該位置的線蟲麻痹)，在平板相對的另一點(b點)滴加乙醇和疊氮化鈉。60 min后，將距a點、b點1.5 cm左右范圍的線蟲數量記為A和B。趨向性指數(CI)=(A-B)/(A+B)。

2 結果

2.1 朱砂對秀麗線蟲運動行為的影響 頭部擺動頻率和身體彎曲頻率作為反映神經系統基本功能的指標，已經被廣泛用于神經毒性的分析。暴露于不同組別朱砂48 h后，各組線蟲身體彎曲頻率和頭部擺動頻率如圖1所示。與對照組比較，暴露于1 μg/cm2WZ的線蟲身體彎曲頻率和頭部擺動頻率無變化，而暴露于5 μg/cm2WZ組的線蟲身體彎曲頻率和頭部擺動頻率降低(P<0.05)。暴露于NZ的2個劑量組后，線蟲身體彎曲頻率和頭部擺動頻率均低于對照組(P<0.01)。對于同粒度材料而言，隨著給藥濃度的增加，線蟲身體彎曲頻率和頭部擺動頻率均有降低的趨勢。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖1 朱砂對線蟲身體彎曲頻率(A)和頭部擺動頻率(B)的影響

2.2 朱砂對秀麗線蟲生長發育的影響 以秀麗線蟲的體長為指標對朱砂導致的秀麗線蟲發育缺陷進行評價，結果不同組別線蟲并沒有產生生長遲緩的現象。如圖2所示，與對照組比較，各組體長均無差異(P>0.05)。由此可見，在0.0～5.0 μg/cm2濃度范圍內，WZ和NZ對線蟲的生長發育均無抑制作用。

圖2 朱砂對線蟲體長的影響

2.3 朱砂對秀麗線蟲生殖行為的影響 為了評價不同粒徑朱砂暴露后對線蟲生殖能力的影響，對線蟲的子代數進行了測定，結果見圖3。與對照組子代數比較，低劑量的WZ對線蟲子代數目的影響無差異(P>0.05)；高劑量WZ和低劑量NZ組的線蟲后代數目減少(P<0.05)，其后代數分別降低了9.6%和11.3%。高劑量NZ組的線蟲后代數減少(P<0.01)，其后代數降低了14.4%。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖3 朱砂對線蟲生殖行為的影響

2.4 朱砂對秀麗線蟲細胞凋亡的影響 本研究采用吖啶橙染色法分析秀麗線蟲細胞凋亡的情況，線蟲染色后，凋亡細胞的核會變為亮綠色或者黃色，而正常細胞則是淡綠色，暴露于不同組別朱砂48 h后，線蟲的細胞凋亡情況如圖4所示。與對照組比較，暴露于WZ的2個劑量組以及低劑量NZ組的線蟲通體均為淺綠色，咽部顏色略深，細胞凋亡并不明顯；高劑量NZ組的線蟲生殖腺部位綠色較深，且體內的卵為亮綠色。表明高劑量NZ一定程度上有導致秀麗線蟲生殖部位細胞發生凋亡的趨勢。

注：A為各組線蟲熒光圖，B為各組線蟲相對熒光強度。圖4 朱砂對線蟲細胞凋亡的影響

2.5 朱砂對秀麗線蟲ROS的影響 活性氧自由基ROS的測定可以反映出機體是否受到氧化損傷，已有研究表明自由基是引起衰老的根本原因，因此，對于ROS的測定是十分有必要的[15]。如圖5所示，與對照組比較，1 μg/cm2WZ對線蟲ROS水平的影響無差異(P>0.05)，5 μg/cm2WZ和1 μg/cm2NZ組的線蟲ROS水平升高(P<0.05)，5 μg/cm2NZ組的線蟲ROS水平升高更多(P<0.01)，達147.2%，這表明WZ和NZ可以通過氧化應激途徑對線蟲產生損傷，且這種損傷作用與朱砂的粒徑和劑量有關。

注：A為各組線蟲熒光圖，B為各組線蟲相對熒光強度。與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖5 朱砂對線蟲體內ROS水平的影響

2.6 朱砂對秀麗線蟲AChE活性的影響 乙酰膽堿酯酶AChE是膽堿能神經在傳遞過程中的一種重要的神經遞質，經常用于神經毒性評價體系，是神經毒性分析的經典指標之一[16]。如圖6所示，與對照組比較，1 μg/cm2WZ對線蟲AChE的活性幾乎無影響，5 μg/cm2WZ和1 μg/cm2NZ能夠抑制線蟲AChE活性(P<0.05)，5 μg/cm2NZ組的線蟲AChE活性的抑制作用更強(P<0.01)，表明NZ和WZ通過影響乙酰膽堿酯酶活性對線蟲產生損傷，且這種損傷與朱砂的粒徑和劑量有關。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖6 朱砂對線蟲乙酰膽堿酯酶活性的影響

2.7 朱砂對秀麗線蟲感知行為的影響 線蟲的趨向性行為能夠綜合反映出線蟲對于外部刺激的學習行為，以及反應敏感性受到化學品的影響程度。如圖7所示，雖然實驗組的趨向系數有略低于對照組的趨勢，但在0～5.0 μg/cm2濃度范圍內，WZ和NZ對線蟲的趨向行為并無明顯影響。

圖7 朱砂對線蟲感知行為的影響

3 討論

朱砂的主要成分為硫化汞，含汞化合物可以經過皮膚、呼吸道和胃腸道進入到人體內，汞離子能與血清白蛋白結合[17]，并隨著血液的循環分布到其他器官和組織，長期服用朱砂的過程中可能會引起肝腎毒性、神經毒性和生殖毒性等[4]。本研究用生命周期較短的模式生物秀麗隱桿線蟲探討了不同粒徑朱砂的毒性作用。

線蟲的運動行為能夠反映出神經系統的基本功能，且多用于重金屬材料神經毒性的分析[18]。線蟲的頭部擺動頻率和身體彎曲頻率是分析其運動行為的常用指標[19]。本研究結果顯示，納米級朱砂組線蟲的身體彎曲和頭部擺動頻率均降低，而微米級朱砂組僅高劑量表現出差異?？梢娋€蟲的運動行為受到了嚴重的影響，這可能是因為朱砂損害了線蟲的運動相關神經元，從而抑制了其運動行為。線蟲的體長是衡量其生長發育的指標之一，能夠反映出秀麗線蟲的發育是否正常。本實驗中線蟲的體長并無變化。表明短時間內，朱砂對線蟲的生長發育并無影響。

后代數目是檢測秀麗線蟲的繁殖能力的重要指標。有報道認為，朱砂對人的生殖能力有損害作用[20]。本研究發現朱砂會導致秀麗線蟲繁殖能力下降，這也進一步證實了朱砂存在著生殖毒性作用，并且這種毒性作用與朱砂的粒徑和暴露劑量有關，證實了朱砂應為“妊娠禁忌藥物”。有研究表明，生物個體行為和生殖上的異?？赡芘cAChE的活性相關[21]。而前文中朱砂對秀麗線蟲的運動和生殖行為的抑制作用與朱砂對線蟲AChE活性的抑制作用一致，因此我們推測這種說法可能是合理的。

細胞凋亡與細胞壞死并不一樣，它是機體為了更好適應生存環境而主動死亡的過程。本實驗結果表明朱砂對細胞凋亡的影響較小。自由基水平可以反映出機體是否受到損傷[19]，自由基過多可能會破壞免疫和信號傳導等過程。實驗結果表明，隨著朱砂濃度升高，秀麗線蟲體內ROS水平也相應增加；而對于同劑量的朱砂，隨著粒徑的減小，其ROS水平有升高的趨勢。相比于微米級朱砂而言，納米級朱砂毒性更大，且兩者的毒性作用均具有一定的濃度依賴性。故可以推測朱砂的毒性可能與自由基代謝紊亂引起的氧化損傷有關。

秀麗線蟲的感知行為主要受化學感應神經元的控制，該實驗常用來分析藥物對記憶和認知功能的影響[22]。本實驗利用秀麗線蟲具有趨向于苯甲醛的特點設計了趨向試驗。結果發現，朱砂對線蟲的趨向行為的影響并不明顯，表明朱砂對秀麗線蟲的記憶損傷并不明顯。

綜上所述，不同劑量不同粒徑的朱砂會降低線蟲的運動行為，損害生殖能力，提高ROS水平，降低AChE活性。朱砂對線蟲的神經系統和生殖能力有明顯的毒性，且存在一定的氧化應激損傷。根據朱砂水飛炮制工藝及質量標準研究[23]可知，朱砂炮制后粒徑要求小于25 μm，但只規定了粒徑上限，沒有規定其下限。本研究前期，對3批不同來源朱砂的粒度進行測定，發現不同批次的朱砂都存在一定比例的小于1 μm的極細朱砂存在。由此說明，對朱砂的炮制工藝研究有必要對其粒徑下限做出規定，以保證臨床用藥安全。本實驗結果表明微米級朱砂在低劑量均表現出相對的安全性，提示我們在朱砂的用藥過程中不可忽視其毒副作用，并需要控制好粒徑和用藥劑量。鑒于秀麗隱桿線蟲的結構較為簡單和完全，和人類相比有較高的保守性，因此，本研究可為后續進一步研究朱砂的毒性及其毒性機制提供一定的參考。