HPLC法同時(shí)測(cè)定刺山柑果實(shí)正丁醇部位中3種成分及該部位抑菌活性

包曉瑋， 趙文燕， 曾蘭君， 魏晨業(yè)， 金渭荃

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆軍區(qū)保障部藥品儀器監(jiān)督檢驗(yàn)站，新疆 烏魯木齊 830052)

刺山柑CapparisspinosaL.為白花菜科山柑屬植物，屬多年生藤本小半灌木[1]，其藥用部位為葉、果實(shí)、根皮，性溫，味辛、苦，具有祛風(fēng)、通鼻竅、止淤消腫、止痛活血之功效，維吾爾族民間常將其果實(shí)搗碎后貼敷，用于治療關(guān)節(jié)炎和肩周炎等疾病[2]。Khanfar[3]從刺山柑中分離得到2個(gè)新化合物，經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定均為生物堿；Sharaf等[4]對(duì)3種山柑屬植物中的黃酮進(jìn)行分析，共發(fā)現(xiàn)23種，其中果實(shí)含槲皮素-3-O-蕓香糖苷、槲皮素-7-O-蕓香糖苷等；Germanò等[5]從刺山柑地上部分中分離得到蘆丁、異鼠李素-3-蕓香苷。

研究表明，蘆丁[6]、對(duì)羥基苯甲酸[7]、異槲皮苷[8]均具有良好的抗菌作用。因此，本實(shí)驗(yàn)在前期基礎(chǔ)上[9-10]建立HPLC法同時(shí)測(cè)定刺山柑果實(shí)正丁醇部位中上述3種成分含量，并評(píng)價(jià)該部位抑菌活性，以期為該藥材質(zhì)量控制提供基礎(chǔ)，也為今后開(kāi)發(fā)天然廣譜抗菌成分提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 LC-20AB高效液相色譜儀，配置SPD-20A紫外檢測(cè)器(日本島津公司)；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；FA2004N型電子天平(上海菁海儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥物 刺山柑于2019年5月購(gòu)于新疆烏魯木齊市北園春批發(fā)市場(chǎng)，經(jīng)新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院藥學(xué)系馬生軍副教授鑒定為正品。蘆丁對(duì)照品(批號(hào)Y16M9S61523，純度≥98%)、對(duì)羥基苯甲酸(批號(hào)MKBK3576V，純度≥99%)(上海源葉生物科技有限公司)；異槲皮苷對(duì)照品(成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)MΜST-18051005，純度≥99.74%)。0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜(美國(guó)Thermo-Fisher公司)。色譜純甲醇、乙腈(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；色譜純甲酸、分析純乙酸銨(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；水為娃哈哈純凈水。

1.3 菌種 大腸桿菌[CMCC(B)44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]，均由新疆維吾爾自治區(qū)藥檢所提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取蘆丁、異槲皮苷、對(duì)羥基苯甲酸對(duì)照品適量，甲醇制成1 mg/mL貯備液，吸取適量并混勻，甲醇稀釋，即得(三者質(zhì)量濃度均為10 μg/mL)，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾。

2.2 供試品溶液制備 取藥材干燥果實(shí)，粉碎后過(guò)60目篩，稱取200 g，按料液比1∶10用80%、50%乙醇各超聲提取3次，每次50 min，提取液合并，減壓濃縮得浸膏，混懸于等量蒸餾水中，按1∶2比例依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，合并正丁醇萃取液，減壓濃縮，得相應(yīng)部位浸膏4.02 g，精密稱取10 mg，10 mL甲醇溶解，即得，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾。

2.3 色譜條件 島津Inertsil ODS-3色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流動(dòng)相乙腈(含0.1%甲酸)-乙酸銨(含0.1%甲酸)(25∶75)；體積流量0.8 mL/min；柱溫40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；進(jìn)樣量20 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

1. 蘆丁 2. 對(duì)羥基苯甲酸 3.異槲皮苷?qǐng)D1 各成分HPLC色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察 將“2.1”項(xiàng)下貯備液用甲醇依次稀釋成32、16、8、4、2、1、0.5 μg/mL對(duì)照品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣20 μL測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，分別以S/N=3、S/N=10為檢出限、定量限，結(jié)果見(jiàn)表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液20 μL，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得蘆丁、對(duì)羥基苯甲酸、異槲皮苷峰面積RSD分別為1.88%、1.85%、1.79%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取正丁醇部位適量，按 “2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、10、12、24 h在“2.3”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣20 μL測(cè)定，測(cè)得蘆丁、對(duì)羥基苯甲酸、異槲皮苷峰面積RSD分別為1.24%、1.77%、1.35%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取正丁醇部位適量，按“2.1”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣20 μL測(cè)定，測(cè)得蘆丁、對(duì)羥基苯甲酸、異槲皮苷峰面積RSD分別為1.60%、1.88%、1.81%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知的正丁醇部位9份，分別80%、100%、120%水平加入對(duì)照品溶液[11]，按 “2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.9 樣品含有量測(cè)定 取正丁醇部位6份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各成分含量測(cè)定結(jié)果(mg/g，n=6)

2.10 抑菌活性研究 精密稱取正丁醇部位浸膏1 g，加入1 mL DMSO充分溶解，得到1 g/mL供試液。將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌在無(wú)菌條件下接種于新鮮斜面固體培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜進(jìn)行活化，再接種于液體無(wú)菌LB培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)。

取編號(hào)1-7的無(wú)菌離心管，無(wú)菌條件下在1號(hào)試管中加入5.4 mL LB液體培養(yǎng)基，其余各管加入3 mL。再于1號(hào)試管中加入0.6 mL供試液，充分混勻至100 mg/mL，吸取3 mL藥液加到2號(hào)管中，振蕩混勻后倍比稀釋，吸取3 mL藥液加到3號(hào)管中，以此類推，2～7號(hào)管中供試液質(zhì)量濃度依次為50、25、12.5、6.25、3.125 mg/mL。在各離心管中加入200 μL金黃色葡萄球菌的菌懸液，充分混勻后封口，37 ℃下恒溫振蕩培養(yǎng)18～24 h。采用活菌計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)菌濃度[12]，以LB液體培養(yǎng)基將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌濃度調(diào)至1×106CFU/mL，取0.2 mL加到各離心管中。同時(shí)，另設(shè)只含LB液體培養(yǎng)基的空白對(duì)照及未加入細(xì)菌的陰性對(duì)照。

供試液在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，各取200 μL至無(wú)菌固體培養(yǎng)基平皿中涂板，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。以平板上無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)或生長(zhǎng)菌落數(shù)小于3個(gè)時(shí)對(duì)應(yīng)的稀釋度為最小抑菌濃度，平板上完全無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)對(duì)應(yīng)的稀釋度為最小殺菌濃度，平行3次，取平均值。結(jié)果，正丁醇部位對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度分別25、25、6.25 mg/mL, 最小殺菌濃度分別為50、32.5、12.5 mg/mL，即對(duì)三者抑制作用大小依次為枯草芽孢桿菌>金黃色葡萄球菌>大腸桿菌。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)考察了流動(dòng)相甲醇-0.1%磷酸(10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50)、乙腈(含0.1%甲酸)-7.5 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)(15∶85、25∶75、30∶70、35∶65、50∶50)及其等度、梯度洗脫方式[13-14]，發(fā)現(xiàn)與甲醇相比，乙腈洗脫能力、分離效果較好，最終確定為乙腈(含0.1%甲酸)-7.5 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)等度洗脫(25∶75)。再考察了體積流量0.8、1.0 mL/min，發(fā)現(xiàn)在0.8 mL/min時(shí)蘆丁、對(duì)羥基苯甲酸、異槲皮苷均能基線分離，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)以蘆丁計(jì)均大于7 000。黃酮紫外光譜在240～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)有2個(gè)吸收帶，處于290～380 nm之間的為帶Ⅰ，處于240～280 nm之間的為帶Ⅱ，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)SPD-20紫外檢測(cè)器得到280、360 nm波長(zhǎng)處對(duì)照品溶液色譜圖[15-17]，發(fā)現(xiàn)蘆丁、異槲皮苷均有較大吸收峰，而且色譜峰峰形良好，分離度理想，但對(duì)羥基苯甲酸在360 nm處無(wú)吸收峰，故選擇280 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

綜上所述，刺山柑果實(shí)正丁醇部位對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌(枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌)的抑制作用大于革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)；從形態(tài)結(jié)構(gòu)分析，革蘭氏陽(yáng)性菌中肽聚糖含量較高，而革蘭氏陰性菌中其含量較低，并且后者最外層外膜為脂多糖，表明活性成分可通過(guò)破壞肽聚糖結(jié)構(gòu)來(lái)抑制細(xì)菌，但對(duì)脂多糖結(jié)構(gòu)的作用較弱。