高燒靈驗(yàn)方對(duì)酵母致熱大鼠的解熱機(jī)制研究

郭起岳，馮學(xué)軒，茹 麗，鄺少松，嚴(yán)家榮，樓彩霞，黃 威，劉月姝，姚欣伶，張 潔

（1廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 廣東 佛山 528248）

（2廣州中醫(yī)藥大學(xué)科技產(chǎn)業(yè)園 廣東 廣州 510445）

發(fā)熱是臨床疾病中最常見的癥狀表現(xiàn)，現(xiàn)代生理學(xué)和病理學(xué)認(rèn)為，發(fā)熱是在致熱原的作用下，體溫調(diào)節(jié)中樞的調(diào)定點(diǎn)上移而引起的調(diào)節(jié)性體溫升高[1]。中醫(yī)中藥治療發(fā)熱性疾病有充分的臨床基礎(chǔ)和文獻(xiàn)依據(jù)，退熱效果顯著，療效穩(wěn)定，不易反復(fù)，安全性高、不良反應(yīng)少、適用范圍廣，具有廣闊的市場(chǎng)前景。

高燒靈驗(yàn)方出自山西中醫(yī)研究院內(nèi)科主任醫(yī)師胡蘭貴編著的《臨證效驗(yàn)秘方》，該方由胡蘭貴醫(yī)師集多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而來，其組成為柴胡20 g、黃芩10 g、瓜蔞60 g，主治邪入膜原、痰熱阻滯證，癥見高熱不退、脈滑或沉滑弦。目前，該方已在臨床應(yīng)用多年，取得了良好的治療效果，但有關(guān)該方的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究尚未見有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。筆者團(tuán)隊(duì)于2019年11月—2020年1月，采用現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)方法，通過建立酵母致大鼠發(fā)熱模型，驗(yàn)證高燒靈驗(yàn)方的解熱作用，并探討其機(jī)制，以期為其今后的深入研究和進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供科學(xué)有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1.材料

1.1 儀器HRQ-A3獸用電子體溫計(jì)（鄭州豪潤奇電子科技有限公司）；Multiskan GO型全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific）。

1.2 藥品與試劑

高燒靈驗(yàn)方（由柴胡20 g、黃芩10 g、瓜蔞60 g組成，共2劑，飲片均購自廣東清源中藥飲片有限公司）；阿司匹林腸溶片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司中國北京，批號(hào)：190309208）；安琪高活性干酵母（安琪酵母股份有限公司，批號(hào)：CA10938）；白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）、前列腺素E2（PGE2）酶聯(lián)免疫試劑盒（武漢華美Biotech,COLTD，批號(hào)：N15017103、N15017102、CO171030116）；環(huán)磷酸腺苷（cAMP）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20191113）。

1.3 動(dòng)物SD大鼠，雄性，體質(zhì)量180～220 g，由廣東省醫(yī)藥動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（粵）2018-0002，動(dòng)物合格證號(hào)44007200070622）。飼養(yǎng)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房，使用許可證號(hào)：SYXK（粵）2018-0002，適應(yīng)性飼養(yǎng)4 d后開始實(shí)驗(yàn)。

2.方法

2.1 高燒靈驗(yàn)方的煎制

按照處方取柴胡40 g、黃芩20 g、瓜蔞120 g（共2劑），10倍量純凈水浸泡30 min后，置煎藥鍋中，先武火煮20 min，然后轉(zhuǎn)文火煎30 min，4層紗布過濾；藥物殘?jiān)^續(xù)加8倍水量，同法煎煮并過濾，合并兩次濾液并濃縮至180 mL，冷卻至室溫，即得濃度為1 g生藥/mL的高燒靈驗(yàn)方水煎液，給藥時(shí)用純凈水將水煎液稀釋至所需濃度。

2.2 分組、造模及給藥[2-4]80只雄性SD大鼠，適應(yīng)條件后，連續(xù)2 d檢測(cè)體溫，選取基礎(chǔ)肛溫在36.5～38.0℃，波動(dòng)在0.5℃以內(nèi)的70只大鼠納入實(shí)驗(yàn)。正式實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，連續(xù)測(cè)量體溫2次，間隔30 min，以2次平均體溫為致熱前基礎(chǔ)體溫，按平均體溫分層隨機(jī)分為正常對(duì)照組（10只）和造模組（60只）。造模組大鼠皮下注射20%的酵母混懸液10 mL/kg體重，制備大鼠干酵母發(fā)熱模型；正常對(duì)照組大鼠皮下注射等體積的氯化鈉注射液。造模后，造模組大鼠每小時(shí)測(cè)體溫1次，連續(xù)5次，5 h后體溫升高不足0.8℃的大鼠淘汰，取體溫升高合格的大鼠共50只，按體溫分層隨機(jī)分為模型對(duì)照組、阿司匹林組、高燒靈驗(yàn)方低、中、高劑量組。高燒靈驗(yàn)方低、中、高劑量組分別按2.5、5、10 g生藥/kg灌胃給予高燒靈驗(yàn)方水煎液（濃度分別為0.25 g、0.5 g、1 g生藥/mL的），阿司匹林組給藥劑量為100 mg/kg，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃給予等體積純凈水。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1體溫 給藥后，每小時(shí)測(cè)量1次體溫，連續(xù)4次。計(jì)算大鼠基礎(chǔ)體溫、造模后5 h、給藥后1 h、2 h、3 h、4 h體溫。

2.3.2血清及下丘腦各致熱因子指標(biāo) 給藥后第4次測(cè)完體溫后，按60 mg/kg腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液麻醉后腹主動(dòng)脈采血，分離血清；采血完畢，放血處死動(dòng)物，取出下丘腦。運(yùn)用ELISA法，按試劑盒說明書測(cè)定血清白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）含量，下丘腦環(huán)磷酸腺苷（cAMP）、前列腺素E2（PGE2）含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3.結(jié)果

3.1 高燒靈驗(yàn)方對(duì)發(fā)熱大鼠體溫的影響

與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠基礎(chǔ)體溫?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；在造模后5 h、給藥后1 h、2 h、3 h、4 h體溫升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。與模型對(duì)照組比較，阿司匹林組、高燒靈驗(yàn)方低、中、高劑量組大鼠基礎(chǔ)體溫及造模后5 h體溫?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；在給藥后1 h、2 h、3 h、4 h，阿司匹林組、高燒靈驗(yàn)方中、高劑量組大鼠體溫降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），高燒靈驗(yàn)方低劑量組大鼠體溫?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

3.2 高燒靈驗(yàn)方對(duì)發(fā)熱大鼠血清IL-1、IL-6含量及下丘腦cAMP、PGE2含量的影響（見表2）：與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠血清IL-1、IL-6含量及下丘腦cAMP、PGE2含量升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。與模型對(duì)照組比較，阿司匹林組、高燒靈驗(yàn)方中、高劑量組大鼠血清IL-1、IL-6含量及下丘腦cAMP、PGE2含量降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），高燒靈驗(yàn)方低劑量組大鼠無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見表1。

表1 高燒靈驗(yàn)方對(duì)發(fā)熱大鼠體溫的影響（±s, n=10）

表1 高燒靈驗(yàn)方對(duì)發(fā)熱大鼠體溫的影響（±s, n=10）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，▲▲P＜0.01，▲P＜0.05。

組別 劑量 基礎(chǔ)體溫/℃ 體溫/℃造模后5 h 給藥后1 h正常對(duì)照組 - 37.87±0.13 37.81±0.20 37.86±0.14模型對(duì)照組 - 37.80±0.21 39.50±0.22** 39.47±0.24**阿司匹林組 100 mg/kg 37.85±0.10 39.48±0.25 38.32±0.24▲▲低劑量組2.5 g生藥/kg 37.79±0.19 39.47±0.29 39.29±0.28中劑量組 5 g生藥/kg 37.77±0.12 39.41±0.35 38.93±0.24▲▲高劑量組10 g生藥/kg 37.87±0.13 39.47±0.26 38.61±0.21▲▲組別 劑量 體溫/℃給藥后2 h 給藥后3 h 給藥后4 h正常對(duì)照組 - 37.86±0.14 37.92±0.10 37.91±0.11模型對(duì)照組 - 39.62±0.33**39.71±0.21**39.54±0.16**阿司匹林組 100 mg/kg 38.26±0.34▲▲38.46±0.27▲▲38.48±0.32▲▲低劑量組2.5 g生藥/kg 39.46±0.35 39.37±0.30 39.32±0.24中劑量組 5 g生藥/kg 38.77±0.29▲▲38.72±0.35▲38.89±0.32▲▲高劑量組10 g生藥/kg 38.39±0.26▲▲38.49±0.28▲▲38.51±0.31▲▲

表2 高燒靈驗(yàn)方對(duì)發(fā)熱大鼠血清及下丘腦各致熱因子的影響（±s, n=10）

表2 高燒靈驗(yàn)方對(duì)發(fā)熱大鼠血清及下丘腦各致熱因子的影響（±s, n=10）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，▲▲P＜0.01，▲P＜0.05。

組別 劑量 血清IL-1β/（pg?mL-1） IL-6/（pg?mL-1）正常對(duì)照組 - 36.38±1.10 7.25±0.65模型對(duì)照組 - 42.88±3.77** 10.96±1.21**阿司匹林組 100 mg/kg 36.72±1.21▲▲ 7.29±0.68▲▲低劑量組2.5 g生藥/kg 39.36±1.75 10.27±1.05中劑量組 5 g生藥/kg 36.96±1.24▲▲ 8.28±0.94▲▲高劑量組10 g生藥/kg 36.73±1.01▲▲ 7.53±0.77▲▲組別 劑量 下丘腦cAMP/（nmol?L-1） PGE2/（pg?mL-1）正常對(duì)照組 - 47.42±9.65 0.90±0.08模型對(duì)照組 - 67.77±6.80** 1.12±0.15**阿司匹林組 100 mg/kg 50.98±9.94▲▲ 0.91±0.08▲▲低劑量組2.5 g生藥/kg 61.82±9.34 1.07±0.10中劑量組 5 g生藥/kg 55.87±11.26▲ 1.00±0.11▲高劑量組10 g生藥/kg 50.37±12.86▲▲ 0.92±0.11▲▲

4.討論

發(fā)熱是指機(jī)體在致熱原作用下或各種原因引起體溫調(diào)節(jié)中樞的功能障礙時(shí)，體溫升高超出正常范圍，而致熱原包括外源性和內(nèi)源性兩大類。外源性致熱源多為大分子物質(zhì)，通過激活血液中的中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，使其產(chǎn)生并釋放內(nèi)源性致熱原，即致熱性細(xì)胞因子，內(nèi)源性致熱原直接或間接通過中樞介質(zhì)作用于體溫調(diào)節(jié)中樞，體溫調(diào)定點(diǎn)上移，引起產(chǎn)熱增加，散熱減少，體溫在一個(gè)新的調(diào)定點(diǎn)達(dá)到平衡時(shí)，從而導(dǎo)致體溫升高[5-6]。

酵母所致發(fā)熱是由于注射部位潰爛引起的劇烈炎癥反應(yīng)，能較好地模擬病理狀態(tài)下的發(fā)熱癥狀。該模型動(dòng)物所表現(xiàn)出來的癥狀與臨床近似，更適合用來考察清熱藥的解熱作用[7]。目前研究表明[3,8-9]，酵母菌作為一種外源性致熱原作用于機(jī)體，引發(fā)內(nèi)生致熱原細(xì)胞分泌內(nèi)生致熱原（IL-1，IL-6，TNF等），直接或通過中樞介質(zhì)（PGE2，cAMP等）間接作用于下丘腦，使體溫調(diào)定點(diǎn)上移，機(jī)體產(chǎn)熱多或散熱少，引起體溫升高。本實(shí)驗(yàn)通過皮下注射20%酵母混懸液建立感染性發(fā)熱大鼠模型，以觀察高燒靈驗(yàn)方的解熱作用及其機(jī)制。結(jié)果顯示，造模后5 h，除正常組外，其余各組體溫均明顯升高，與正常組體溫比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明造模均成功，且模型組與各給藥組間體溫比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，故又保證了給藥組與模型組的較好可比性。給藥后1～4 h，模型組體溫仍明顯升高；高燒靈驗(yàn)方中、高劑量組體溫明顯降低，提示高燒靈驗(yàn)方有良好的解熱作用。給藥后4 h，模型組大鼠血清IL-1β、IL-6和下丘腦PGE2、cAMP含量均顯著升高，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[3,6,9-10]一致；高燒靈驗(yàn)方中、高劑量組血清IL-1β、IL-6和下丘腦PGE2、cAMP含量與發(fā)熱模型組比較均顯著降低，提示高燒靈驗(yàn)方可降低血清IL-1β、IL-6的水平及下丘腦PGE2、cAMP的水平。

高燒靈驗(yàn)方組成簡單，方中的柴胡、黃芩、瓜蔞均有良好的退熱作用，為日常生活中的常見藥，價(jià)廉易得，三藥配伍較單味用藥效果更好，這也體現(xiàn)了中醫(yī)藥“相須”配伍的科學(xué)性，具備中藥配伍的基本特點(diǎn)。本文以柴胡、黃芩、瓜蔞配伍，充分運(yùn)用現(xiàn)代藥效學(xué)理論和實(shí)驗(yàn)方法，探討柴胡、黃芩、瓜蔞配伍作為一個(gè)整體入藥時(shí)表現(xiàn)出的解熱作用及其機(jī)制，結(jié)果表明高燒靈驗(yàn)方可快速降溫，效果確切，持續(xù)時(shí)間較長，其退熱機(jī)制可能與抑制血清中IL-1β和IL-6的產(chǎn)生或釋放，減少下丘腦PGE2和cAMP的合成，從而發(fā)揮解熱作用有關(guān)。