β-環糊精包合羚珠散的制備工藝及其抗驚厥活性分析

薛 錚，杜丹陽，劉嫣蓉，楊 琰，劉 瑩，劉 康，石心紅（通訊作者）

（中國藥科大學 江蘇 南京 211198）

羚珠散作為一種兒科散劑，常用于治療小兒發熱驚厥。在2015版藥典之前，散劑不允許添加輔料。石菖蒲油和冰片是羚珠散中揮發性成分，不穩定[1]，致使其在制劑生產和貯存過程中損失較大[2]。中醫治療癇癥有長久的歷史。羚珠散在治療癲癇時起效緩慢，但作用時間持久，可以有效遏制腦細胞異常放電而引起的熱性驚厥[3]。因此，本研究采用環糊精包合的技術，有效提高其穩定性的同時，保證該方的藥效。本實驗采用研磨法制備β-環糊精（β-CD）包合物，通過正交設計法研究冰片和石菖蒲油的包合最佳工藝條件。此外，通過戊四氮（PTZ）致癇小鼠模型[4]，考察羚珠散原方及優化方對小鼠癲癇樣行為的影響，探究其抗癇的生理機制。

1.實驗材料

1.1 儀器與設備

MT5超微量級天平（METTLER TOLEDO公司），BT 125D電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]，LQ-C50001電子天平（深圳市飛亞衡器有限公司），KH-500DB型數控超聲波清洗器（昆山市禾創超聲波儀器有限公司），YL-100B實驗室超純水機（深圳市億利源水處理設備有限公司），DZF-6090真空干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司），DHG-9023A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海申賢恒溫設備廠），DIONEX UltiMate 3000 Autosampler UHPLC液相色譜儀（賽默飛世爾科技公司），GC-2010氣相色譜儀（日本島津公司）。

1.2 藥品與試劑

石菖蒲油、冰片、朱砂和羚珠散（由雷允上藥業集團有限公司提供，批號：8-030725、BP1807003-180821、20181202-181224和SAob003），環糊精（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20161215），β-細辛醚（中國食品藥品檢定研究院，批號：112018-201601），龍腦（中國食品藥品檢定研究院，批號：110881-201709），戊四氮（上海源葉生物科技有限公司，批號：A20J10 L91178），苯妥英鈉（安徽雙鶴藥業有限責任公司生產，批號：180419 6B），甲醇（色譜純，美國天地有限公司）。其他試劑均為分析純。

1.3 動物

SPF級 雄 性ICR小 鼠（3～4周），體 重14～18 g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，實驗動物許可證號碼SCXK（滬）2018-0006。所有實驗操作均符合動物倫理學要求（倫理審批號：CPU2019021）。

2.混合揮發性成分β-CD包合物的制備及藥效學評價

2.1 HPLC法測定包合物中β-細辛醚的含量

PRAZIS Absolute? C18色譜柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）；流動相：甲醇-水（60:40）；檢測波長：253 nm；流速：1 mL/min；柱溫：30℃；進樣體積：10 μL。理論塔板數以β-細辛醚計算應不低于6 000。

2.2 GC法測定包合物中龍腦的含量

以WONDACAP 1為固定相的毛細管色譜柱（30 m×0.53 mm，1.50 μm）；氫火焰離子化檢測器（FID）；柱溫：100℃保持1 min，10℃/min程序升溫至250℃；氣化室溫度：270℃；檢測器溫度：270℃；載氣：He；色譜柱流量：6.89 mL/min；尾吹氣：N2，30.0 mL/min；氫氣流量：40.0 mL/min；空氣流量：400 mL/min；分流比：10:1；進樣量：1 μL。理論塔板數以龍腦計算應不低于6 000。

2.3 包合工藝的優化

精密稱取適量β-CD置于研缽中，加入適量純水研磨均勻。精密稱取冰片和石菖蒲油，加入無水乙醇溶液混勻。將上述溶液滴入研缽中，在規定時間內連續研磨至糊狀。先用少量水洗，再用少量乙酸乙酯洗，于45℃真空干燥5 h，精密稱定包合物質量，通過下列計算包合物得率。采用正交試驗優化混合β-CD包合物的包合工藝，選取影響因素較大的研磨時間（A）、揮發油與β-CD的比例（B）及揮發油與水的比例（C）。

包合物得率=包合物質量/（揮發性成分投入量+環糊精投入量）×100%

2.4 包合物的包合率和含油率測定

精密稱定包合物粉末100 mg，置50 mL容量瓶中，加入甲醇，充分振搖，超聲處理1.5 h，放冷，定容至刻度線，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液1。取包合物粉末約100 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加入無水乙醇，充分振搖，超聲處理60 min，放冷，定容至刻度線，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液2。精密吸取供試品溶液1按照“2.1”，供試品溶液2按照“2.2”項下條件進行測定，測定β-細辛醚和龍腦的峰面積。通過下列公式計算包合物中包合率和含油率。正交實驗結果見表1，方差分析見表2。

表1 正交試驗表

表2 方差分析表

包合率=稱取樣品中揮發性成分的重量/[揮發性成分投入量×（稱取樣品的重量/包合物總重量）×空白回收率]×100%

含油率=稱取樣品中揮發性成分的重量/[（揮發性成分投入量+環糊精投入量）×空白回收率]×100%

方差分析結果顯示，影響包合物包合效果的主次關系為環糊精與水比例>研磨時間>揮發油與環糊精的比例。最優參數為：研磨時間35 min，投料比1:8，溶劑比1:1。其中投料比和溶劑比對工藝都有顯著影響。

2.5 驗證試驗

按篩選出的最佳包合工藝進行驗證。分別制備3批包合物，包合物得率、包合率和含油率平均值分別為97.78%、98.23%、4.50%，表明該工藝穩定可行。

2.6 戊四氮誘導小鼠驚厥

取ICR小鼠按體重隨機分組，每組10只，共6組：模型組，陽性藥組（苯妥英鈉50 mg/kg），羚珠散原方高低劑量組（1.0、0.5 g/kg），羚珠散優化方高低劑量組（1.0、0.5 g/kg）。每天給藥組灌胃給予不同劑量藥液（0.1 mL/kg），模型組給予0.9%氯化鈉溶液，連續3 d，末次給藥前禁食不禁水12 h。末次給藥后1 h，腹腔注射PTZ（110 mg/kg）。觀察小鼠發作時的行為變化，按Racine分級[5]，記錄其從注射PTZ到發生驚厥的陣攣潛伏期、強直潛伏期、死亡時間。相比于模型組，各組強直潛伏期和死亡時間都有明顯延長，且呈劑量依賴性。陽性藥組和優化方高低劑量組的強直潛伏期和死亡時間，與模型組相比差異有統計學意義（P＜0.01）。經Fisher確切概率法檢驗，提示死亡率差異有統計學意義。通過組間的兩兩比較，陽性組、優化方高低劑量組與模型組差異有統計學意義（P＜0.05），說明這三組能顯著抑制戊四氮導致的小鼠死亡。提示羚珠散中揮發性成分的包合是有意義的，見表3。

表3 羚珠散原方及優化方對戊四氮致癇小鼠的影響（±s, n=10）

表3 羚珠散原方及優化方對戊四氮致癇小鼠的影響（±s, n=10）

注：與空白組比較，*P＜0.05；**P＜0.01。

組別 陣攣潛伏期/s 強直潛伏期/s 死亡時間/s 死亡率/%模型組 41.80±7.35 281.30±147.62 314.60±149.57 100.00陽性藥組 52.20±5.81 1 800.00±0.00* 1 800.00±0.00* 0.00*原方低劑量組45.90±5.45 510.60±453.88 603.60±442.99 90.00原方高劑量組47.60±7.39 614.40±432.44 646.60±418.92 90.00優化方低劑量組 48.10±11.13 1 051.90±536.81*1 338.40±496.86*50.00*優化方高劑量組 57.20±15.25 1 212.60±521.90*1 445.00±475.13*40.00*

3.討論

本實驗基于羚珠散中揮發性成分不穩定而展開，從企業的生產條件和工藝技術的成熟程度考慮，本研究選擇將石菖蒲油和冰片制備成β-CD包合物。β-CD的空腔大小適合包合揮發油這類相對分子質量較小的成分，且成本較低。研磨法因為操作簡單，且包合率較高，在生產上被廣泛使用。正交試驗結果說明優化后的包合物制備方法簡單可行、重復性好。

驚厥實驗結果表明，羚珠散在包合后能顯著延長驚厥小鼠的存活時間，降低死亡率，且比未包合的組方抗驚厥效果更優，為羚珠散包合工藝研究提供了理論基礎。石菖蒲油的抗癲癇作用在臨床上已有較多文獻報道。而石菖蒲油和冰片的“引藥上行”作用，也使得這兩味藥作為佐使藥，在治療癲癇時被廣泛配伍使用[6]。因此，這兩味藥在羚珠散的抗癲癇活性中起到重要作用。本研究初步驗證了包合物的體內抗驚厥活性，但關于其抗驚厥作用的分子機制及其在體外是否也有較好的抗驚厥作用等尚不清楚，需要更深入的研究。