晝夜節律及其相關基因與非酒精性脂肪性肝病的關系

趙晨露， 趙文霞

1 河南中醫藥大學 第一臨床醫學院， 鄭州 450016； 2 河南中醫藥大學第一附屬醫院 脾胃肝膽科， 鄭州 450000

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是常見的慢性肝病，組織學以肝臟脂肪積聚為特征，在疾病進展過程中可見肝臟脂肪變、肝纖維化、肝硬化甚至肝細胞癌[1]。NAFLD發病機制尚不明確，廣泛接受的是“多重打擊學說”，該學說在經典“二次打擊學說”基礎上，認為NAFLD發生與多種因素共同作用有關，包括胰島素抵抗、遺傳及表觀遺傳、腸道菌群、脂肪組織分泌的脂肪因子等[2]。最近有學者[3]認為晝夜節律紊亂可能成為NAFLD發病過程中的又一打擊因素。本文基于近年來的相關數據，總結了晝夜節律基因參與NAFLD發病過程中的作用機制，為臨床早期防治提供理論依據。

1 晝夜節律概述

1.1 晝夜節律的形成 哺乳動物的晝夜節律以24 h為一個周期，可精確調節睡眠-覺醒周期、進食-禁食周期、內分泌節律以及新陳代謝節律等生理活動[4]。晝夜節律是一種細胞自主的分子機制，晝夜節律振蕩器賦予相關基因有節律的表達，將生理和行為同步到晝夜周期內[5]。哺乳動物晝夜節律振蕩器由分子鐘操作，位于下丘腦視交叉上核中的生物振蕩器又稱為中心時鐘或主時鐘[6]，其可通過體液(皮質醇、褪黑激素等)、物理(溫度變化)和神經的輸出信號來調節外圍時鐘(包括肝臟、脂肪組織、胰腺等)，從而協調新陳代謝功能[7]。

1.2 晝夜節律的分子調控 分子鐘由多個轉錄-翻譯反饋環組成(圖1)，其中核心循環包括周期蛋白(period, PER)和隱花色素家族 (cryptochrome，CRY)，它們的表達被大腦和肌肉芳香烴受體核轉運蛋白1(brain and muscleArnt-like protein-1, BMAL1)和晝夜運動輸出周期蛋白(circadian locomotor output cycles kaput, CLOCK)激活，后兩者組成的異二聚體與E-box增強子序列結合后，可以啟動PER和CRY基因的轉錄[8]，隨后在細胞質中形成PER:CRY異二聚體，進入細胞核后抑制BMAL1∶CLOCK介導的轉錄，形成第一條自主反饋環路；BMAL1∶CLOCK異二聚體還可以誘導過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferators-activated receptors α, PPARα)、視黃酸相關孤兒核受體(retinoid-related orphan nuclear receptors,ROR)、核激素受體REV-ERB等核受體的轉錄，PPARα和ROR可以激活BMAL1基因的表達，而REV-ERB則抑制BMAL1轉錄提供負反饋[9]，形成了第二條自主反饋環路；最近研究[10]已發現DECs(DEC1和DEC2)的表達也起著時鐘基因的功能，DEC可以通過與BMAL1結合或者與BMAL1∶CLOCK競爭E-box的結合位點來抑制自身的轉錄，DEC還可以抑制Per1的轉錄，這可以形成第三條自主反饋環路；此外，研究[11]發現白蛋白D位點結合蛋白基因和E4BP4可以結合D-box，激活和抑制轉錄以穩定和微調PER /CRY反饋環，從而促進第四環的形成。這種相互作用對于產生和維持晝夜節律機制的正確運作至關重要。

圖1 晝夜節律的分子調控機制

2 晝夜節律與NAFLD的關系

相關臨床研究[12]顯示，經常輪班倒班的女護士2型糖尿病的發生風險較高，且與輪班倒班的工作年限呈正相關(1～5年、5～9年、≥10年其2型糖尿病發生風險分別為1.09、1.28、1.47)；慢性睡眠限制和晝夜節律中斷會導致體內32%的胰島素分泌減少，這可能是促使此類人群患糖尿病風險增高的原因[13]。熬夜、輪班等生活方式使內部時鐘與環境時態之間失去同步，導致晝夜節律紊亂，打亂了體內胰島素、瘦素、脂聯素、褪黑素分泌的固有節律，導致進食行為改變、糖脂代謝改變以及體質量增加，促使NAFLD、肥胖、2型糖尿病等代謝性疾病的發病率大大增加[14]。基礎研究[15]亦發現，改變明暗周期(光照20 h，黑暗4 h)后夜間沙漠嚙齒動物出現了肝組織結構的改變和肝細胞代謝活性的下降，前者以廣泛分散的炎癥灶、白細胞浸潤、結締組織延伸為主，與Kupffer細胞激活趨化中性粒細胞有關；后者以高血糖、血脂波動等代謝紊亂為主，與光照周期改變引起的PER2基因節律表達的破壞有關。與其他外周組織的晝夜節律相比，肝臟的晝夜節律更容易受持續光照的影響，持續光照明顯降低了肝臟中CLOCK、BMAL1、CRY1、PER1和大多數參與肝脂質代謝的基因的節律性表達[16]。這些證據均表明，晝夜節律能夠影響肝臟的代謝活性。

2.1 晝夜節律基因參與脂質代謝

肝臟是脂質代謝的主要場所，通過調節脂蛋白的合成、脂質的吸收和轉化、脂肪酸的氧化來參與脂質代謝。全基因組基因表達研究[17]證實了肝臟多種生理活動均受晝夜節律的調節，其中包括肝臟脂質代謝。晝夜節律基因通過調節脂質代謝過程中的限速酶和轉運蛋白的表達，從而維持脂代謝平衡，防止脂肪過多堆積。其中CLOCK、BMAL1、REV-ERB、ROR、PER、CRY等晝夜節律基因是脂質代謝的關鍵調節劑。

2.1.1 CLOCK/BMAL1 在不同的動物模型中，晝夜節律紊亂將導致脂質代謝障礙。CLOCK或BMAL1基因突變小鼠會產生高甘油三酯血癥和高膽固醇血癥[18]，全身性敲除CLOCK基因的小鼠模型表現出飲食增加、高脂血癥和體質量增加[19]。BMAL1在脂肪儲存、利用和脂肪細胞分化中起重要作用。全身性BMAL1敲除小鼠表現出葡萄糖耐受不良、低胰島素血癥、脂肪儲存減少、肝臟和肌肉中異位脂肪形成增加以及即使常規喂食也會引起肝脂肪變性[20]；肝臟特異性BMAL1敲除小鼠在禁食期間表現出低血糖、游離脂肪酸水平升高、肝甘油三酯增加等血脂異常[21]。脂肪細胞BMAL1特異性缺失導致小鼠肥胖、食物攝入的晝夜節律發生改變，血漿甘油三酯和葡萄糖水平的晝夜節律變化消失[22]。

2.1.2 REV-ERB/ROR REV-ERB和ROR基因是將生物鐘與脂質代謝聯系起來的重要組成部分。REV-ERB和ROR已被證明與脂肪細胞的分化、脂肪形成和脂質儲存有關[23-24]。REV-ERB和ROR分別作為轉錄抑制因子和激活因子，共同控制參與脂質代謝的蛋白質及靶基因的晝夜節律表達[25]。REV-ERB和ROR可以識別相同的DNA結合位點但執行相反的調節功能[26]。全身雙敲除REV-ERBα和REV-ERBβ小鼠出現核心時鐘和脂質代謝相關基因的節律表達發生改變，出現高血糖、高脂血癥和肝脂肪變性[27]。相比之下，RORα及其配體可以誘導超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)2和谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase,GPx)1的表達，減少肝臟的氧化應激和炎癥反應，從而減輕非酒精性脂肪性肝炎[28]；此外，研究[29]發現RORα還可以增強肝臟Kupffer細胞的M2極化，通過分泌抗炎和免疫調節性細胞因子IL-10來保護肝細胞免受損傷。

2.1.3 PER/CRY PER2除了與核心時鐘基因結合外，還可以通過抑制白色脂肪和肝臟中PPARα、PPARγ的轉錄來調節脂質代謝[30]。PER3可以通過兩種方式調節脂肪形成：(1)通過調節脂肪細胞前體細胞的節律來調節體內脂肪形成；(2)通過調節Krüppel樣因子的表達來參與脂肪形成，當刪除PER3時脂肪形成節律喪失，脂肪生成增加以及肝臟發生脂肪變性[31]。

這些證據表明與脂質代謝相關的晝夜節律基因的表達異常可以誘發宿主脂代謝節律喪失，從而促進了肝臟脂肪沉積。

2.2 晝夜節律基因參與葡萄糖代謝 葡萄糖代謝是一個嚴格的調節過程，涉及胰腺產生胰高血糖素和胰島素、肝臟中的糖原分解和糖異生作用以及肌肉和脂肪組織在胰島素作用下從血液中攝取葡萄糖[32]。在哺乳動物中，存在于各種組織和器官中大約80%的蛋白質編碼基因在轉錄水平上顯示出晝夜節律振蕩。參與糖代謝過程的激素(如胰高血糖素、胰島素、瘦素等)的血漿水平顯示出晝夜節律振蕩[33]。

目前研究較多的與糖代謝密切相關的晝夜節律基因是BMAL1基因，其模型包括全身BMAL1基因敲除和外周組織特異性BMAL1基因敲除(表1)。全身BMAL1基因敲除小鼠不僅出現血脂紊亂、肝臟、肌肉、脂肪組織中脂質沉積等脂代謝紊亂的表型，而且也觀察到糖代謝異常的現象，如葡萄糖耐量減低、胰島素分泌減少，以及胰島素抵抗和肥胖[34-35]。也有報道[36]顯示全身或者血管平滑肌BMAL1基因敲除小鼠出現了血壓、心率的晝夜節律紊亂，可能與血管重塑受損、血管損傷以及血管內皮功能紊亂有關。

表1 不同部位晝夜節律基因BMAL1敲除或沉默對糖代謝的影響

胰腺特異性BMAL1基因敲除小鼠出現了胰島素分泌改變。由于胰島β細胞內抗氧化酶基因表達水平較低，SOD水平僅為肝臟的30%，過氧化氫酶(catalase,CAT)及GPx僅為肝臟的5%[37]，因此β細胞清除活性氧(reactive oxygen species,ROS)、抗氧化能力較弱，對氧化應激損傷更敏感[38]。研究[39]顯示，抑制胰腺β細胞BMAL1基因表達后，核因子E2相關因子2(nuclear factor-E2 related factor 2, Nrf2)mRNA表達增加，CAT和GPx表達減少，提示抑制BMAL1基因表達會導致高水平的氧化應激狀態，超出了β細胞的抗氧化能力，導致細胞氧化應激損傷。同時電鏡下觀察到抑制BMAL1表達后，β細胞表現出線粒體腫脹、線粒體嵴斷裂和消失，進一步說明了BMAL1基因表達異常是通過氧化應激途徑導致了β細胞功能損傷。另一項研究[38]發現，將小鼠胰腺β細胞BMAL1基因沉默后，去乙酰化酶Sirt1基因表達減少，Sirt1在細胞凋亡中起重要的調節作用，主要通過組蛋白/非組蛋白去乙酰化影響基因轉錄，從而發揮抗氧化、減少細胞凋亡、增加細胞存活率的作用。提示BMAL1基因主要通過調節氧化應激通路影響胰島β細胞的功能和凋亡。

BMAL1不僅在胰腺中，而且對肝臟、骨骼肌、脂肪組織等外周器官的糖代謝有重要作用。肝臟BMAL1敲除小鼠在禁食期間表現出低血糖，參與肝臟糖代謝基因的晝夜節律表達改變，血液中葡萄糖清除受損[40]。小鼠骨骼肌BMAL1特異性缺失造成葡萄糖攝取減少、葡萄糖轉運蛋白表達降低，由于參與骨骼肌糖酵解的關鍵酶活性降低，導致肌肉組織葡萄糖代謝受損，使小鼠體內葡萄糖穩態受到干擾，發生葡萄糖耐量降低或胰島素抵抗[41]。同樣小鼠脂肪組織BMAL1特異性缺失導致肥胖、食物攝入的晝夜節律改變，血漿甘油三酯、葡萄糖水平的晝夜節律變化消失[42]，提示脂肪組織BMAL1基因與脂質代謝、脂肪酸氧化和能量穩態調節有關。這些證據表明，外周生物鐘在葡萄糖的調節中同樣起著重要作用。

2.3 晝夜節律影響腸道菌群 研究[43]表明腸道菌群的改變參與了NAFLD的發生。Snijder等[44]首次在藍藻菌和真菌中發現其代謝水平呈現晝夜節律性，與光照時間有關。隨后的一系列實驗證實了腸道菌群也存在晝夜變化。這種晝夜節律變化主要表現在腸道菌群的組成與豐度、功能活動兩方面。在組成與豐度方面，通過將小鼠置于模擬的人工晝夜環境中(12 h光照、12 h黑暗)，在ZT0、ZT6、ZT12、ZT18時分別進行糞便取樣以及細菌測序，結果顯示15%的菌群在豐度方面呈現出周期性變化，大多屬于梭菌目、乳桿菌目以及擬桿菌目[45]。其中擬桿菌門的總數在23∶00和11∶00波動較大，其他時間波動較小，而厚壁菌門的總數晝夜波動較小，由此推測擬桿菌門數量的晝夜波動是構成腸道菌群晝夜節律的主要驅動力[46]。在功能活動方面，由于腸道菌群在數量上呈現晝夜波動，其也導致腸道菌群的功能隨之波動，從而適應宿主的生理代謝。嚙齒類動物在夜間進食期間，宿主的能量代謝等活動較活躍，同時伴隨腸道菌群中的厚壁菌門、擬桿菌門數量增多；在白天休眠時期，宿主的解毒、胃腸蠕動等活動較活躍，同時伴隨腸道菌群中的乳桿菌數量增多[45]。此外，腸道黏膜通透性也受到晝夜節律基因的控制，可能與緊密連接結構中的閉合蛋白和緊密連接蛋白1的晝夜節律性表達有關[47]。

腸道菌群的節律性變化是由宿主驅動的，宿主進食-禁食節律可調節腸道微生物的功能，因此，明暗交替是哺乳動物中樞生物鐘的授時因子，進食時間是腸道菌群生物鐘的授時因子。PER1/2雙敲除小鼠表現出腸道菌群和其部分功能的晝夜節律明顯改變,但是給予長期規律性飲食后發現腸道菌群的部分節律性得到了恢復[48]，說明改變宿主飲食的節律性可以恢復腸道菌群的節律性波動，提示對于因腸道菌群失調引起的肥胖、2型糖尿病、代謝綜合征、脂肪肝等代謝疾病的治療可以從調整節奏性飲食的角度思考。

2.4 晝夜節律基因參與氧化應激 氧化代謝是所有需氧生物的正常生理過程，也是ROS的主要來源。生理條件下多余的ROS被細胞抗氧化系統清除。當氧化分子(如超氧化物和過氧化氫)的產生超過抗氧化分子(如CAT、GPx、SOD、NAPDH)的清除能力時，就會發生氧化應激。ROS清除系統對于代謝細胞的功能和存活至關重要，過量的ROS會引起脂質和蛋白質的過氧化以及蛋白質和核酸的氧化修飾，從而引起代謝和心血管并發癥[49]。氧化應激可通過刺激脂肪前細胞增殖、脂肪形成和慢性炎癥而引起脂肪組織功能障礙，從而導致肥胖[50]。同樣氧化應激在NAFLD的發生、發展中起關鍵作用，ROS引起脂質過氧化，繼而導致炎癥反應和肝星狀細胞的激活，促進纖維化的發生[2]。

在晝夜周期中，脂質過氧化和蛋白質氧化水平在關鍵的代謝器官或組織(如肝臟和肌肉)中表現出晝夜節律性。許多具有抗氧化作用的酶(如GSH-Px、SOD)以及褪黑素等在其表達或活性水平上具有晝夜節律性，因此氧化應激與生物鐘有著先天的聯系[51]。在哺乳動物細胞和小鼠肝臟中觀察到H2O2水平的晝夜節律振蕩，并可以通過半胱氨酸氧化直接調節CLOCK晝夜節律功能[52]。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)不僅自身具有晝夜節律振蕩，而且是能量代謝和晝夜節律控制之間的重要環節[53]。CLOCK:BMAL1異二聚體的結合活性取決于細胞的氧化還原狀態，即NADH/NAD和NADPH/NADP比值，而NADPH/NADP比值以晝夜節律振蕩[54]。磷酸戊糖途徑可以通過NADPH代謝來調節肝臟生物鐘。抑制磷酸戊糖途徑可以增加氧化應激、延長晝夜節律、激活Nrf2通路、增加CLOCK：BMAL1異二聚體DNA的結合并改變鐘控基因的表達[55]。以上證據支持氧化應激和晝夜節律相互關聯的假設，晝夜節律調節細胞氧化還原功能的節律性振蕩，而細胞中氧化還原狀態的變化也會影響生物鐘基因。

2.5 晝夜節律基因參與內質網應激 蛋白質的折疊和組裝主要在內質網中完成，內質網通過精細的機制保證折疊正確的蛋白質輸出并發揮其功能，但是對于折疊不正確的蛋白質，內質網在分子伴侶的配合下將其組裝成天然復合物進行降解。當細胞或環境應激源破壞內質網功能時，未折疊的或者折疊錯誤的蛋白質就會在內質網中聚集，這種情況稱為內質網應激。機體為了應對內質網應激，細胞激活一系列復雜而協調的信號轉導途徑，稱為未折疊蛋白反應(unfolded protein reaction, UPR)[56]。UPR是一種生存反應，可以修飾轉錄和翻譯程序以恢復內質網穩態。

UPR途徑主要由3種細胞應激傳感器啟動：跨膜激酶/核酸內切酶1、雙鏈RNA活化蛋白激酶樣激酶、活化轉錄因子6。UPR在維持肝脂質穩態方面起著關鍵作用，在應激條件下，UPR的破壞會導致肝脂肪變性和非酒精性脂肪性肝炎。敲除或者抑制小鼠肝臟中跨膜激酶/核酸內切酶1或活化轉錄因子6，會導致在急性內質網應激或高脂飲食條件下發生肝脂肪變性[57]。此外，內質網應激誘導的轉錄激活因子XBP1缺乏時也會導致肝脂質蓄積[58]。以上證據表明肝臟UPR途徑可以防止肝脂質沉積。

參與肝臟代謝的許多酶位于內質網膜上，晝夜節律會影響肝臟的脂質代謝和內質網定位酶。晝夜節律紊亂導致XBP1介導的UPR激活的節律振蕩，并引起內質網定位酶的失調，導致固醇調節元件結合蛋白轉錄因子的異常激活[59]，促使脂質生成增加，誘發肝臟脂肪變。

3 小結

綜上所述，晝夜節律基因參與了NAFLD發病過程中的多種機制，目前晝夜節律相關的動物實驗模型以全身基因敲除為主，肝臟特異性晝夜節律基因敲除的研究較少，因此需要進一步開展肝臟特異性基因敲除的基礎研究，而且有必要開發一種具有人類輪班工作特征的標準動物模型，以更好的理解晝夜節律基因在外周器官中的作用機制，繼續闡述晝夜節律基因與NAFLD發病的分子途徑和機理，為臨床治療提供數據。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：趙晨露負責撰寫論文；趙文霞負責指導撰寫文章、修改論文。