新疆地區FGB基因多態性對纖維蛋白原水平及膽囊結石發病的影響

阿麗葉古麗·艾皮熱， 皮爾地瓦斯·麥麥提玉素甫， 王 儉， 艾克拜爾·艾力,，克力木·阿不都熱依木,

新疆維吾爾自治區人民醫院 a.普外微創研究所， b.微創、疝和腹壁外科， 烏魯木齊 830001

纖維蛋白原(fibrinogen, Fg)是纖維蛋白的前體，即凝血因子I，是一種不對稱的大分子量蛋白質，是血漿中含量最高的凝血因子，主要是作為凝血因子 I 直接參與凝血過程。血漿Fg水平升高是血栓性疾病、心腦血管病的重要危險因素，也參與膽囊膽固醇結石的形成[1-4]。

Fg是一種急性期反應產物，由Aα、Bβ和γ三對對稱排列的多肽鏈組成，其生物合成受遺傳和環境等多種因素的影響，其中基因多態性是導致個體間血漿Fg水平差異的重要遺傳因素，而纖維蛋白原β鏈(FGB)基因多態性是造成其水平差異的重要因素之一[5-7]。雖然，多項研究報道了Fg基因多態與其水平關聯，但無文獻報道該基因多態和膽囊結石的關聯。故筆者在前期研究中，以基因多態性研究為出發點，對膽囊結石患者FGB基因的變異進行了系統的篩查，篩查出了17個多態性位點。而在本研究中，根據篩查結果，并結合參考文獻[8-10]報道，選擇rs4220、rs1044291兩個多態性位點進行基因型分析結合單體型分析，明確 FGB 基因rs4220、rs1044291位點多態性對Fg水平的影響及與新疆維吾爾族、漢族人群膽囊結石的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2017年12月—2020年5月在本院住院的膽囊結石患者150例，去掉信息不全1例和測序失敗1例，入組148例。對照組為同期在本院體檢的非膽囊結石者150例，去掉臨床信息不全1例，入組149例。所有受試對象均采集性別、年齡、身高、體質量、BMI、空腹血脂、總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等臨床資料。

1.2 主要設備與試劑 實時熒光定量PCR儀(CFX96 bio-rad，美國)，ND5000(Thermo，美國)，3730XL基因測序儀(Applied Biosystems Inc.，美國)，普通PCR儀(ABI 9700)，Taq酶(Fermentas，加拿大)，Taq DNA ligase(NEB，美國)，qPCR PreMix(Probe)(天根，FP208)，dNTP(Fermentas，加拿大)，ExoI酶(Fermentas，加拿大)，FastAP酶(Fermentas，加拿大)，Snapshot試劑盒(ABI，美國)。

1.3 方法

1.3.1 血漿Fg水平測定 采用全自動血凝分析儀AMAX200(磁珠法)測定血漿Fg水平。由本院醫學檢驗中心統一測定。

1.3.2 單核苷酸多態性分型 標本采集：清晨空腹采集3 ml肘靜脈血于含EDTA的抗凝管中，置于-80 ℃保存。基因組DNA提取：采用酚/氯仿法提取外周血DNA，-20 ℃保存。基因分型：采用SNaPshot技術進行SNP分型。位點引物由上海吉真生物科技有限公司合成，各位點PCR引物及單堿基延伸引物見表1。

表1 PCR引物及單堿基延伸引物序列

1.4 倫理學審查 本試驗方案經新疆維吾爾自治區人民醫院倫理委員會審核批準，批號： 2017D01C096。

2 結果

2.1 一般資料 在維吾爾族人群中，HDL-C在膽囊結石組和對照組之間有顯著差異(P<0.05)，而年齡、收縮壓、舒張壓、BMI、游離脂肪酸、TC、TG、LDL-C、Fg在膽囊結石組和對照組之間差異均無統計學意義(P值均>0.05)。在漢族人群中，舒張壓、游離脂肪酸、Fg水平在膽囊結石組和對照組之間差異均有統計學意義(P值均<0.05)，而年齡、收縮壓、BMI、TC、TG、LDL-C、HDL-C間差異均無統計學意義(P值均>0.05)(表2)。

表2 研究對象的一般特征

2.2 FGB基因多態位點基因型分布與膽囊結石的關系

2.2.1 Hardy-Weinberg檢驗 經Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗發現FGB基因rs4220、rs1044291多態性位點基因觀察值和期望值相吻合。膽囊結石組、對照組P值均>0.05，表明研究對象的選擇無遺傳學偏差，該群體是遺傳平衡群體，具有一定的可靠性及代表性(表3)。

表3 膽囊結石組FGB基因rs4220、rs1044291位點分布頻率Hardy-Weinberg平衡檢驗

2.2.2 FGB基因多態位點基因型和等位基因頻率分布

在膽囊結石及對照組中FGB多態位點基因型和等位基因頻率的單變量分析表明，在維吾爾族、漢族研究人群中rs4220、rs1044291位點基因型的分布及頻率在膽囊結石組和對照組間均無顯著差異(P值均>0.05)(表4)。

表4 FGB基因rs4220、rs1044291位點基因型分布

2.3 FGB基因rs4220、rs1044291位點多態性與血漿Fg水平 因上述FGB基因rs4220、rs1044291多態性位點的TT或AA基因型檢出率過低，故將CT、TT或AG、AA基因型合并為一組來分析。結果顯示，在漢族人群中，膽囊結石組與對照組間比較， rs4220位點的GG基因型者血漿Fg水平高于對照組(Z= -3.04，P<0.05)， rs1044291位點T基因攜帶者較對照組血漿Fg水平增高，差異有統計學意義(t=2.8，P<0.05)。 在維吾爾族人群中，膽囊結石組與對照組間比較，只有rs4220位點的A基因攜帶者血漿Fg水平高于對照組，差異有統計學意義(Z=-2.41，P<0.05)。兩個民族膽囊結石組、對照組內各基因型Fg水平比較差異均無統計學意義(P值均>0.05)(表5)。

表5 膽囊結石組與對照組中各基因型與血漿Fg水平的關系

2.4 影響膽囊結石病危險因素分析 本研究采用多因素二分類logistic回歸評估Fg定量、族別、高血壓、BMI、游離脂肪酸、年齡等自變量對研究對象患膽囊結石的影響。結果顯示族別與Fg是膽囊結石的危險因素，Fg每增加一個單位，患膽囊結石的風險增加5.3%(P=0.042)；維吾爾族相較于漢族，患膽囊結石的風險增加 80.4%(P=0.014)(表6)。

表6 影響膽囊結石的危險因素分析

3 討論

在西方國家，膽囊結石病發病率為5.9%～21.9%[11]，在我國膽囊結石的發病率為 4.2%～11.0%[12]。新疆為我國膽囊結石高發區，其患病率為15%，其中南疆患病率 (17.5%)高于北疆 (13.5%)[13]。膽石癥已逐漸成為影響新疆各民族健康的主要問題之一。膽囊結石的成因非常復雜，是一種與遺傳、內分泌功能紊亂、代謝、營養及環境因素等相關的多因性疾病。根據化學成分分類，膽結石可以分為膽固醇性膽結石、膽色素性膽結石和混合性膽結石[14]。莊建華等[15]對新疆維吾爾族和漢族的膽結石類型進行研究，發現維吾爾族、漢族膽結石類型存在差異：維吾爾族膽結石以單純膽結石多見，且以膽固醇型結石為主，而漢族主要為肝膽管結石，主要成分為膽色素結石。

文獻[3]報道，膽囊膽固醇結石患者膽囊中的Fg水平、抗凝血酶Ⅲ抗原高于非膽石患者，而抗凝血酶Ⅲ活性低于非膽石患者；纖溶酶原水平低于非膽石患者，纖溶酶活性高于非膽石患者，提示纖維蛋白可能受凝血和纖溶因子的影響而在膽囊結石的形成中發揮著作用。本研究結果顯示，在漢族人群中，膽囊結石組Fg水平高于對照組，與上述結果一致，但在維吾爾族人群中，Fg水平在膽囊結石組與對照組間無差異，表明Fg水平增高可能與漢族膽囊結石的發生相關。經多因素logistic回歸分析也發現，民族與Fg水平是膽囊結石的危險因素。

已有較多研究顯示FGB-455G/A多態性與血漿Fg水平相關。Canseco-Avila等[16]對墨西哥西南部118例冠心病伴血栓形成患者進行的研究顯示，FGB-455G/A、-148C/T多態性與血漿高Fg水平具有相關性。李軍廷等[2]研究顯示，腔隙性腦梗死組和對照組AA+AG基因型受試者血漿Fg水平均顯著高于GG基因型受試者，考慮FGB-455G/A位點A等位基因可能獨立或與其他因素協同作用提高血漿Fg水平。但Cronjé等[17]對南非黑種人進行的一項橫斷面研究并未發現FGB-455G/A多態性與總體Fg水平之間存在相關性。本研究結果顯示，在漢族人群中，膽囊結石組與對照組間比較，膽囊結石組中rs4220位點GG基因型者血漿Fg水平均高于對照組， rs1044291位點T基因攜帶者較對照組血漿Fg水平增高，差異均有統計學意義。在維吾爾族人群中，膽囊結石組rs4220位點的A基因攜帶者血漿Fg水平均低于對照組，差異有統計學意義。但兩個民族膽囊結石組、對照組內各基因型者Fg水平均無差異。這表明影響維、漢兩民族膽囊結石患者血漿Fg水平的FGB基因多態位點基因型不同。提示該多態性對血漿Fg水平的影響可能與地區及種族有關。

國內外對 FGB基因多態性的研究多集中在與腦梗死、冠心病、高血壓及慢性阻塞性肺疾病的研究上，但未有文獻報道該基因多態性與膽囊結石的相關性，故筆者對新疆維吾爾族、漢族人群FGB基因的變異進行了系統的篩查，篩查出17個多態位點，并結合參考文獻報道，選擇對rs4220、rs1044291兩個多態位點進行基因型分析發現在維吾爾族、漢族中rs4220、rs1044291兩個多態位點基因型的分布及頻率在膽囊結石組與對照組間無差異。該結果表明FGB基因rs4220、rs1044291位點多態性可能通過調控Fg水平參與新疆人群膽囊結石的發病。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：阿麗葉古麗·艾皮熱、克力木·阿不都熱依木負責課題設計，資料分析，撰寫論文；皮爾地瓦斯·麥麥提玉素甫、王儉、艾克拜爾·艾力參與收集全血標本及臨床數據；阿麗葉古麗·艾皮熱負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。