新疆地區(qū)FGB基因多態(tài)性對纖維蛋白原水平及膽囊結(jié)石發(fā)病的影響

阿麗葉古麗·艾皮熱， 皮爾地瓦斯·麥麥提玉素甫， 王 儉， 艾克拜爾·艾力,，克力木·阿不都熱依木,

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院 a.普外微創(chuàng)研究所， b.微創(chuàng)、疝和腹壁外科， 烏魯木齊 830001

纖維蛋白原(fibrinogen, Fg)是纖維蛋白的前體，即凝血因子I，是一種不對稱的大分子量蛋白質(zhì)，是血漿中含量最高的凝血因子，主要是作為凝血因子 I 直接參與凝血過程。血漿Fg水平升高是血栓性疾病、心腦血管病的重要危險因素，也參與膽囊膽固醇結(jié)石的形成[1-4]。

Fg是一種急性期反應產(chǎn)物，由Aα、Bβ和γ三對對稱排列的多肽鏈組成，其生物合成受遺傳和環(huán)境等多種因素的影響，其中基因多態(tài)性是導致個體間血漿Fg水平差異的重要遺傳因素，而纖維蛋白原β鏈(FGB)基因多態(tài)性是造成其水平差異的重要因素之一[5-7]。雖然，多項研究報道了Fg基因多態(tài)與其水平關(guān)聯(lián)，但無文獻報道該基因多態(tài)和膽囊結(jié)石的關(guān)聯(lián)。故筆者在前期研究中，以基因多態(tài)性研究為出發(fā)點，對膽囊結(jié)石患者FGB基因的變異進行了系統(tǒng)的篩查，篩查出了17個多態(tài)性位點。而在本研究中，根據(jù)篩查結(jié)果，并結(jié)合參考文獻[8-10]報道，選擇rs4220、rs1044291兩個多態(tài)性位點進行基因型分析結(jié)合單體型分析，明確 FGB 基因rs4220、rs1044291位點多態(tài)性對Fg水平的影響及與新疆維吾爾族、漢族人群膽囊結(jié)石的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2017年12月—2020年5月在本院住院的膽囊結(jié)石患者150例，去掉信息不全1例和測序失敗1例，入組148例。對照組為同期在本院體檢的非膽囊結(jié)石者150例，去掉臨床信息不全1例，入組149例。所有受試對象均采集性別、年齡、身高、體質(zhì)量、BMI、空腹血脂、總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等臨床資料。

1.2 主要設(shè)備與試劑 實時熒光定量PCR儀(CFX96 bio-rad，美國)，ND5000(Thermo，美國)，3730XL基因測序儀(Applied Biosystems Inc.，美國)，普通PCR儀(ABI 9700)，Taq酶(Fermentas，加拿大)，Taq DNA ligase(NEB，美國)，qPCR PreMix(Probe)(天根，F(xiàn)P208)，dNTP(Fermentas，加拿大)，ExoI酶(Fermentas，加拿大)，F(xiàn)astAP酶(Fermentas，加拿大)，Snapshot試劑盒(ABI，美國)。

1.3 方法

1.3.1 血漿Fg水平測定 采用全自動血凝分析儀AMAX200(磁珠法)測定血漿Fg水平。由本院醫(yī)學檢驗中心統(tǒng)一測定。

1.3.2 單核苷酸多態(tài)性分型 標本采集：清晨空腹采集3 ml肘靜脈血于含EDTA的抗凝管中，置于-80 ℃保存。基因組DNA提取：采用酚/氯仿法提取外周血DNA，-20 ℃保存。基因分型：采用SNaPshot技術(shù)進行SNP分型。位點引物由上海吉真生物科技有限公司合成，各位點PCR引物及單堿基延伸引物見表1。

表1 PCR引物及單堿基延伸引物序列

1.4 倫理學審查 本試驗方案經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會審核批準，批號： 2017D01C096。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 在維吾爾族人群中，HDL-C在膽囊結(jié)石組和對照組之間有顯著差異(P<0.05)，而年齡、收縮壓、舒張壓、BMI、游離脂肪酸、TC、TG、LDL-C、Fg在膽囊結(jié)石組和對照組之間差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。在漢族人群中，舒張壓、游離脂肪酸、Fg水平在膽囊結(jié)石組和對照組之間差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)，而年齡、收縮壓、BMI、TC、TG、LDL-C、HDL-C間差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)(表2)。

表2 研究對象的一般特征

2.2 FGB基因多態(tài)位點基因型分布與膽囊結(jié)石的關(guān)系

2.2.1 Hardy-Weinberg檢驗 經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗發(fā)現(xiàn)FGB基因rs4220、rs1044291多態(tài)性位點基因觀察值和期望值相吻合。膽囊結(jié)石組、對照組P值均>0.05，表明研究對象的選擇無遺傳學偏差，該群體是遺傳平衡群體，具有一定的可靠性及代表性(表3)。

表3 膽囊結(jié)石組FGB基因rs4220、rs1044291位點分布頻率Hardy-Weinberg平衡檢驗

2.2.2 FGB基因多態(tài)位點基因型和等位基因頻率分布

在膽囊結(jié)石及對照組中FGB多態(tài)位點基因型和等位基因頻率的單變量分析表明，在維吾爾族、漢族研究人群中rs4220、rs1044291位點基因型的分布及頻率在膽囊結(jié)石組和對照組間均無顯著差異(P值均>0.05)(表4)。

表4 FGB基因rs4220、rs1044291位點基因型分布

2.3 FGB基因rs4220、rs1044291位點多態(tài)性與血漿Fg水平 因上述FGB基因rs4220、rs1044291多態(tài)性位點的TT或AA基因型檢出率過低，故將CT、TT或AG、AA基因型合并為一組來分析。結(jié)果顯示，在漢族人群中，膽囊結(jié)石組與對照組間比較， rs4220位點的GG基因型者血漿Fg水平高于對照組(Z= -3.04，P<0.05)， rs1044291位點T基因攜帶者較對照組血漿Fg水平增高，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.8，P<0.05)。 在維吾爾族人群中，膽囊結(jié)石組與對照組間比較，只有rs4220位點的A基因攜帶者血漿Fg水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(Z=-2.41，P<0.05)。兩個民族膽囊結(jié)石組、對照組內(nèi)各基因型Fg水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)(表5)。

表5 膽囊結(jié)石組與對照組中各基因型與血漿Fg水平的關(guān)系

2.4 影響膽囊結(jié)石病危險因素分析 本研究采用多因素二分類logistic回歸評估Fg定量、族別、高血壓、BMI、游離脂肪酸、年齡等自變量對研究對象患膽囊結(jié)石的影響。結(jié)果顯示族別與Fg是膽囊結(jié)石的危險因素，F(xiàn)g每增加一個單位，患膽囊結(jié)石的風險增加5.3%(P=0.042)；維吾爾族相較于漢族，患膽囊結(jié)石的風險增加 80.4%(P=0.014)(表6)。

表6 影響膽囊結(jié)石的危險因素分析

3 討論

在西方國家，膽囊結(jié)石病發(fā)病率為5.9%～21.9%[11]，在我國膽囊結(jié)石的發(fā)病率為 4.2%～11.0%[12]。新疆為我國膽囊結(jié)石高發(fā)區(qū)，其患病率為15%，其中南疆患病率 (17.5%)高于北疆 (13.5%)[13]。膽石癥已逐漸成為影響新疆各民族健康的主要問題之一。膽囊結(jié)石的成因非常復雜，是一種與遺傳、內(nèi)分泌功能紊亂、代謝、營養(yǎng)及環(huán)境因素等相關(guān)的多因性疾病。根據(jù)化學成分分類，膽結(jié)石可以分為膽固醇性膽結(jié)石、膽色素性膽結(jié)石和混合性膽結(jié)石[14]。莊建華等[15]對新疆維吾爾族和漢族的膽結(jié)石類型進行研究，發(fā)現(xiàn)維吾爾族、漢族膽結(jié)石類型存在差異：維吾爾族膽結(jié)石以單純膽結(jié)石多見，且以膽固醇型結(jié)石為主，而漢族主要為肝膽管結(jié)石，主要成分為膽色素結(jié)石。

文獻[3]報道，膽囊膽固醇結(jié)石患者膽囊中的Fg水平、抗凝血酶Ⅲ抗原高于非膽石患者，而抗凝血酶Ⅲ活性低于非膽石患者；纖溶酶原水平低于非膽石患者，纖溶酶活性高于非膽石患者，提示纖維蛋白可能受凝血和纖溶因子的影響而在膽囊結(jié)石的形成中發(fā)揮著作用。本研究結(jié)果顯示，在漢族人群中，膽囊結(jié)石組Fg水平高于對照組，與上述結(jié)果一致，但在維吾爾族人群中，F(xiàn)g水平在膽囊結(jié)石組與對照組間無差異，表明Fg水平增高可能與漢族膽囊結(jié)石的發(fā)生相關(guān)。經(jīng)多因素logistic回歸分析也發(fā)現(xiàn)，民族與Fg水平是膽囊結(jié)石的危險因素。

已有較多研究顯示FGB-455G/A多態(tài)性與血漿Fg水平相關(guān)。Canseco-Avila等[16]對墨西哥西南部118例冠心病伴血栓形成患者進行的研究顯示，F(xiàn)GB-455G/A、-148C/T多態(tài)性與血漿高Fg水平具有相關(guān)性。李軍廷等[2]研究顯示，腔隙性腦梗死組和對照組AA+AG基因型受試者血漿Fg水平均顯著高于GG基因型受試者，考慮FGB-455G/A位點A等位基因可能獨立或與其他因素協(xié)同作用提高血漿Fg水平。但Cronjé等[17]對南非黑種人進行的一項橫斷面研究并未發(fā)現(xiàn)FGB-455G/A多態(tài)性與總體Fg水平之間存在相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，在漢族人群中，膽囊結(jié)石組與對照組間比較，膽囊結(jié)石組中rs4220位點GG基因型者血漿Fg水平均高于對照組， rs1044291位點T基因攜帶者較對照組血漿Fg水平增高，差異均有統(tǒng)計學意義。在維吾爾族人群中，膽囊結(jié)石組rs4220位點的A基因攜帶者血漿Fg水平均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義。但兩個民族膽囊結(jié)石組、對照組內(nèi)各基因型者Fg水平均無差異。這表明影響維、漢兩民族膽囊結(jié)石患者血漿Fg水平的FGB基因多態(tài)位點基因型不同。提示該多態(tài)性對血漿Fg水平的影響可能與地區(qū)及種族有關(guān)。

國內(nèi)外對 FGB基因多態(tài)性的研究多集中在與腦梗死、冠心病、高血壓及慢性阻塞性肺疾病的研究上，但未有文獻報道該基因多態(tài)性與膽囊結(jié)石的相關(guān)性，故筆者對新疆維吾爾族、漢族人群FGB基因的變異進行了系統(tǒng)的篩查，篩查出17個多態(tài)位點，并結(jié)合參考文獻報道，選擇對rs4220、rs1044291兩個多態(tài)位點進行基因型分析發(fā)現(xiàn)在維吾爾族、漢族中rs4220、rs1044291兩個多態(tài)位點基因型的分布及頻率在膽囊結(jié)石組與對照組間無差異。該結(jié)果表明FGB基因rs4220、rs1044291位點多態(tài)性可能通過調(diào)控Fg水平參與新疆人群膽囊結(jié)石的發(fā)病。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻聲明：阿麗葉古麗·艾皮熱、克力木·阿不都熱依木負責課題設(shè)計，資料分析，撰寫論文；皮爾地瓦斯·麥麥提玉素甫、王儉、艾克拜爾·艾力參與收集全血標本及臨床數(shù)據(jù)；阿麗葉古麗·艾皮熱負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。