新型冠狀病毒突變株對傳染性和疾病進展及免疫保護影響的研究進展①

何曉波 虞淦軍 吳艷峰

（海軍軍醫大學免疫學研究所暨醫學免疫學國家重點實驗室，上海200433）

自2019年末，新型冠狀病毒引發的疫情迅速波及全球，是20世紀以來有報道的第3種人高致病性冠狀病毒。此次疫情病原體被正式確認為一種新型冠狀病毒，國際病毒分類學委員會命名其為SARS-CoV-2（severe acute respiratory syndrome coro‐navirus 2）[1］，世界衛生組織命名該病毒引發的肺炎為COVID-19（coronavirus disease-19）。截至目前，國內疫情在良好的防控措施下已得到有效控制，然而國外疫情依舊嚴峻，全球累計病例已超過1億，死亡人數超200萬[2］。疫情初期，各國即開展了針對SARS-CoV-2基因數據的分析及相應抗體、疫苗的研發工作，目前國內外均有新冠疫苗相繼緊急獲批使用。然而隨著SARS-CoV-2在人群中不斷傳播，病毒基因逐漸發生突變積累并進而發展為不同的突變株，這對疫情防控提出了新的挑戰。首先，突變株可能伴隨關鍵位點的突變從而產生更強的傳染力或致病性；其次，部分位點的突變可能降低病毒與已有特異性抗體的結合力，對疾病的治療帶來負面影響；再次，突變可能影響到現有疫苗的免疫保護作用和范圍，使病毒感染的預防面臨更加嚴峻的形勢。為了有效應對病毒突變帶來的新的潛在風險，研究人員通過GISAID基因序列數據庫[3-4］共享全球地區發現的SARS-CoV-2突變株基因序列，已鑒定若干突變的位點及突變頻率。現階段，及時掌握SARS-CoV-2突變株的發展變化，研究其在傳染致病、診療預防等方面的影響，將有利于各國在疫情防控中實施更具預見性和有效性的防治措施。

1 SARS-CoV-2的基因組結構及生物學特性

SARS-CoV-2為新發現的β屬冠狀病毒，直徑60～140 nm，具有包膜及單鏈、正義的RNA基因組[5］。SARS-CoV-2基因組結構如圖1所示，其兩側存在5'和3'端非翻譯區，具有RNA合成所需的二級結構[6］；5'端起依次包括2個較長的開放性閱讀框（open reading frames，ORFs）ORF1a和ORF1b，主要編碼16種非結構蛋白（non-structural protein，nsp），分別在病毒基因轉錄、復制、多聚蛋白修飾等過程中發揮重要作用；剩余接近3'端的基因組為編碼結構蛋白和其他輔助蛋白的ORFs。編碼的結構蛋白主要包括4種，刺突蛋白（spike protein，S蛋白）為一類跨膜蛋白，能與宿主細胞受體結合并介導感染，含有主要的抗原表位；膜糖蛋白（membrane protein，M蛋白）最為豐富，在病毒的形態發生、維持中發揮作用；小包膜蛋白（envelope glycoprotein，E蛋白）在病毒復制中具有整合、釋放等功能，與病毒致病機制相關；核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，N蛋白）是核衣殼中的唯一蛋白，在病毒衣殼化中具有重要作用[7］。輔助蛋白的具體功能仍有待進一步研究闡述，但目前認為其高度可變，在病毒感染及致病中發揮一定的功能[8］。

圖1 SARS-CoV-2的基因組結構[6］Fig.1 Genome structure of SARS-CoV-2[6］

SARS-CoV-2進入人體后通過S蛋白受體結合區（receptor-binding domain，RBD）特異性識別并結合人血管緊張素轉化酶2受體（human angiotensin converting enzyme 2，hACE2），從 而 入 侵 宿 主 細胞[9-10］。隨著對SARS-CoV-2入侵機制的深入研究，研究者陸續發現了一系列新的潛在宿主細胞受體，例如神經纖毛蛋白1（neuropilin-1，NRP1）、去唾液酸糖蛋白受體1（asialoglycoprotein receptor 1，ASGR1）和環狀跨膜蛋白1（kringle containing transmembrane protein 1，KREMEN1）等[11-13］。進入宿主細胞后，病毒RNA可作為信使RNA（messenger RNA，mRNA）利用宿主蛋白合成系統產生自身所需的各類蛋白產物，如病毒ORF1a和ORF1b首先翻譯產生多聚蛋白pp1a和pp1ab，并通過水解、加工產生16種非結構蛋白（nsp1～nsp16），可分別發揮基因復制校正、降低宿主細胞基因表達等生物功能，并進一步組裝形成關鍵的病毒復制轉錄復合物，共同完成病毒RNA的大量復制；四種結構蛋白通過宿主細胞內質網和高爾基體途徑合成后，與協同產生的病毒RNA組裝為完整病毒顆粒，通過胞吐脫離宿主細胞[8，14］。

回顧性研究表明人體感染SARS-CoV-2后主要存在發燒、咳嗽、乏力、呼吸急促等臨床癥狀，胸部影像學檢查通常表現為毛玻璃樣陰影，大部分患者臨床診斷為肺炎，癥狀較輕且預后良好，部分重癥或轉為重癥的患者可能因嚴重的呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）、多器官功能衰竭、膿毒癥休克等并發癥而死亡[15-16］。有研究推測，SARS-CoV-2的基本傳染數R0可達2.47～2.86，具有較高的傳染性，相似于SARS-CoV的2.2～3.6，但其致病性似乎低于另外兩種高致病性冠狀病毒SARS-CoV和MERS-CoV[17-19］。

2 SARS-CoV-2突變的機制及特點

2.1 SARS-CoV-2的突變機制 SARS-CoV-2作為RNA病毒，本身具有較高突變率，進化速度顯著高于其他物種，其發生突變的機制尚未闡明，但目前認為低保真性的RNA依賴的RNA聚合酶（RNAdependent RNA polymerases，RdRps）是RNA病毒高突變率的重要原因之一，此外宿主細胞內多種活性物質可能促進病毒基因的突變，例如APOBEC蛋白酶家族的堿基脫氨作用、作用于RNA的腺苷脫氨酶（adenosine deaminases acting on RNA，ADAR）的腺苷脫氨作用、活性氧化物（ROS）的氧化作用等，以及病毒復制周期中RNA與其他相關基因之間發生同源重組而造成的遺傳重組[20-23］。但也有研究表明，冠狀病毒中存在一定的基因校對機制用以糾正復制錯誤，如非結構蛋白nsp14的3'至5'核酸外切酶活性可能是其基因復制的保真性機制之一[24-25］。

SARS-CoV-2在上述機制的共同作用下發生突變，但大部分突變個體可能因突變的不利影響而被自然選擇消除，值得注意的是，隨著疫情的長期持續，尤其在國外感染病例不斷增多、疫情沒有得到有效控制的情況下，SARS-CoV-2與感染人群的長期共存可能導致突變不斷積累，在選擇作用下迅速產生具有適應性優勢的SARS-CoV-2突變毒株，從而造成更大危害。日前，世衛組織已正式發布了4株主要的突變毒株，提示SARS-CoV-2突變帶來潛在風險的可能性。

2.2 SARS-CoV-2相關突變位點 目前，全球已報告多個SARS-CoV-2突變株在不同基因位點上發生突變，部分非同義突變因發生頻率高或具有潛在的生物學影響而受到廣泛關注。此外，對4254個SARS-CoV-2基因序列的分析表明，4種結構蛋白中S、N蛋白基因更易發生突變，其突變頻率明顯高于E、M蛋白[26］。其中，S蛋白既是介導入侵的重要組分，又是抗體作用的主要靶標，因此S蛋白突變是目前最重要的監測對象，如近期報告的S蛋白N501Y和N439K突變賦予病毒與hACE2受體更強的親和力，且N439K突變能造成對部分中和性單克隆抗體的抗性[27-28］。表1為部分SARS-CoV-2的非同義高頻突變及熱點突變匯總[29-33］。

表1 SARS-CoV-2相關突變位點Tab.1 Mutation sites of SARS-CoV-2

3 目前已報道的重要SARS-CoV-2突變株

3.1 D614G突變株 2020年2月底，研究者首次觀察到SARS-CoV-2中出現23403位的A核苷酸轉變為G核苷酸的非同義突變，該突變編碼病毒的S蛋白D614G突變，且該突變常伴隨C241T、C3037T、C14408T基因突變[34-35］。至2020年6月，包含該突變的SARS-CoV-2突變株頻率逐漸上升，由最初的歐洲地區局部流行，迅速發展為全球傳播的SARSCoV-2主要類型。

D614G突變株的出現頻率在全球各地區迅速提高的模式，提示該突變可能賦予了病毒更強的感染力，從而促使病毒更容易在人群中傳播。YURK‐OVETSKIY等[36］研究表明攜帶D614G的假病毒對穩定表達ACE2受體的細胞的感染力是D614的3～9倍，且不局限于hACE2，證實D614G的突變能提高病毒的體外感染力，其他研究結果也支持這一結論[35，37］。但D614G突變并不影響S蛋白的合成、加工，以及與hACE2受體的結合、親和力，進一步的結構研究顯示，D614G突變通過改變S蛋白構象，在原始D614全封閉、單開放構象的基礎上，進一步形成更為開放的雙開放和三開放構象，這種更高開放比例的構象提高了S蛋白與hACE2受體結合的可能性[36］。此外，研究發現D614G突變可能促進了患者體內更高的病毒載量。VOLZ等[38］通過病毒樣本PCR循環閾值（Ct）的檢測，發現D614G突變樣本比原始毒株具有更低的循環閾值，KORBER等[35］的研究同樣發現D614G突變與患者上呼吸道高水平的病毒核酸相關，兩者結果均提示了D614G突變與高病毒載量間的相關性，但進一步的臨床數據分析并未顯示D614G突變改變了患者疾病的嚴重程度。D614G突變編碼的病毒S蛋白是目前治療性抗體、疫苗的重要靶點，多項研究評估了不同種類單克隆抗體對D614G突變病毒和D614病毒的中和效應，結果表明兩者間并未有明顯差異，部分抗體對D614G突變體甚至表現出高于D614的中和作用，在血清抗體中和實驗中也得到了類似的結果[39-41］。因此，D614G突變似乎并不會對治療性抗體和疫苗的免疫保護產生負面影響。

3.2 水貂相關突變株 2020年4月，研究者首次在荷蘭養殖水貂中觀察到SARS-CoV-2感染[42］，隨后丹麥國家公共衛生研究所報告SARS-CoV-2在當地養殖水貂中廣泛傳播后發生突變，并進一步傳染給人類[43］，引發圍繞水貂養殖場的日德蘭半島地區新型突變株疫情流行，丹麥食品衛生部門于11月開展對養殖場水貂的撲殺工作[44］。

HAMMER等[29］通過序列比對分析發現，突變株與武漢發現的毒株相比存在9個非同義突變，與歐洲20B分支毒株對比存在T730I、Y453F、H182Y 3種新突變，并推測病毒T730I突變最初產生于人體中，進一步傳染水貂后產生適應性的Y453F和H182Y突變。其他研究表明，水貂相關突變株中還存在S蛋白相關的I692V、S1147L和HV69-70del突變，其中Y453F位于高度保守的S蛋白受體結合基序中，使其增加了與ACE2受體的親和力，可能是促進該病毒感染人體的原因之一[43］；KEMP等[45］通過假病毒結合實驗表明具有HV69-70del突變的假病毒比野生型具有更高的傳染性。該類突變株在水貂養殖場與周圍人類社區中迅速傳播，但未在全球發生大規模流行，其傳播可能與職業接觸及養殖場位置相關，一般人感染的可能性較低，臨床數據也未顯示該突變株引起患者疾病嚴重程度的改變[46］。但血清抗體中和實驗提示，水貂突變株對中和抗體存在較低敏感性，因而對疫苗或抗體介導的免疫保護可能具有潛在影響，但仍需進一步研究確定[43］。

3.3 B.1.1.7（501Y.V1）突變株 B.1.1.7突變株最早于英國英格蘭東南部地區被采集發現，隨著相關病例數的不斷上升，迅速流行，直至目前全球多地已報告了該突變株相關病例。B.1.1.7突變株序列上具有17個特殊突變，包括14個非同義突變與3個缺失突變，其中N501Y、P681H、HV69-70del突變位于S蛋白并初步顯示出潛在的重要生物學意義[32］。STARR等[27］評估了攜帶不同突變的S蛋白片段與ACE2受體間的結合作用，結果顯示N501Y突變的S蛋白片段展現出顯著增強的ACE2受體親和力，提示該突變可能促進了突變株的感染能力。P681H突變的具體影響尚不明確，但其位置毗鄰Furin蛋白酶切位點，目前認為S蛋白能在Furin蛋白酶切作用下形成更開放的構象，從而提高與ACE2受體結合的親和力[47-48］，因此相鄰的P681H突變可能影響病毒結合并入侵細胞，但仍需進一步研究。HV69-70del如上3.2中所述，可能增強了病毒傳染力[45］。B.1.1.7突變株總體上顯示出更強的傳染性，DAVIES等[49］根據COVID-19患者住院人數、ICU床位覆蓋率、病死率等因素建立數學預測模型，推斷B.1.1.7突變株的傳播能力比其他毒株高56%，其他研究通過SGTF PCR檢測分析同樣證實該突變株具有更強傳播能力[50］。此外，一項英國伯明翰大學公布的研究中，研究者利用TaqPath RT-QPCR對641份病毒樣品進行檢測，發現B.1.1.7突變株感染患者的樣本中具有更高的病毒載量[51］，另一項研究針對英格蘭地區SARS-CoV-2感染病例進行數據分析，結果首次證明B.1.1.7突變株造成了更高的患者病死率，這些研究在一定程度上提示了突變株可能存在增強的毒力[52］。

3.4 B.1.351（501Y.V2）突變株 南非地區于2020年7月和10月爆發兩次疫情高峰，研究人員對南非3月至11月收集的2589個SARS-CoV-2病毒樣本進行基因分析，鑒定了一株新的SARS-CoV-2突變體——B.1.351（501Y.V2），并確定為第2次疫情高峰的主要流行株[33］。該突變株在S蛋白中存在除D614G突變以外另外8個非同義突變，其中K417N、E484K和N501Y突變受到廣泛關注，三者均位于受體結合域，而E484K、N501Y位于更關鍵的受體結合基序中。N501Y突變已在B.1.1.7突變株中得到鑒定，如上3.3中所述。在STARR等[27］的評估中，K417N、E484K突變均一定程度上增強了與ACE2受體結合的親和力，K417N突變還可能導致部分單克隆抗體的失效[53］。也有研究顯示E484K突變極大地降低了血清中和抗體的作用效果，而K417N和N501Y突變則無明顯影響[54-55］。WIBMER等[56］利用假型慢病毒中和實驗評估了510Y.V2的假病毒對血清中和抗體的影響，結果顯示48%的中和抗體未檢測到中和活性，在僅含RBD區突變（K417N、E484K、N501Y）的假病毒中有27%的中和抗體未檢測到中和活性，這一結果提示510Y.V2突變株對康復患者依舊存在再感染風險，且可能對目前基于S蛋白設計的疫苗預防效果存在影響。

4 SARS-CoV-2突變株的影響與意義

4.1 突變對SARS-CoV-2特性的影響 目前，研究人員在D614G、B.1.1.7、B.1.351、水貂突變株中均鑒定出有可能增強其與宿主細胞ACE2受體的結合或提高親和力的突變，這與突變株迅速流行的特性一致，提示突變可能提高SARS-CoV-2的傳染性。其次，部分研究表明相關突變株在體外或體內的病毒載量要高于原始毒株，且突變株造成患者病死率的升高，因而突變可能進一步提高了SARS-CoV-2的致病性[52］。此外，包含突變株部分突變或突變組合的假病毒在血清中和實驗中表現出對康復患者血漿中和抗體敏感性的下降[57-58］，已知人體感染病毒后能激發CD8+T細胞介導的細胞免疫[59］，而對747個SARS-CoV-2病毒樣本的深度測序表明，病毒出現若干MHCⅠ限制性CD8+T細胞表位的非同義突變，而這些突變能減弱表位與MHCⅠ分子的結合并降低細胞毒性T淋巴細胞應答[60］，表明突變從體液免疫和細胞免疫多方面促進SARS-CoV-2對機體免疫的逃逸能力。而水貂相關突變株的出現則提示SARS-CoV-2在非人類宿主體內發生適應性突變并擴大傳播的可能性，使新冠疫情面臨更難控制的潛在風險，表2為目前已報道的主要SARS-CoV-2突變株情況。

表2 已報道的主要SARS-CoV-2突變株情況Tab.2 Major reported SARS-CoV-2 variants

4.2 SARS-CoV-2突變株對患者診斷和治療的影響 COVID-19患者的診斷方法主要包括核酸檢測和抗體檢測。核酸檢測是利用實時熒光RT-PCR進行病毒基因檢測，是目前檢測的金標準，抗體檢測則因患者在感染早期尚未產生特異性抗體而出現假陰性結果，因此常作為輔助診斷[61］。雖然核酸檢測的引物序列大多來源于病毒基因組不同位置的保守序列，但SARS-CoV-2發生的大量突變依然可能影響PCR分析的敏感性和特異性，多個研究報告表明不同的基因突變如E蛋白基因C26340T、N蛋白基因C29200T與C29200A影響了PCR檢測的敏感性[62-64］，因此針對不同基因區域進行多靶標PCR檢測對COVID-19的診斷顯得十分必要。

特異性抗體是治療SARS-CoV-2的重要藥物之一，然而病毒基因突變可能導致抗原蛋白結構變化，從而影響抗體的療效。STARR等[65］的一項前瞻性研究繪制了逃避治療性抗體的SARS-CoV-2突變圖譜，其中E406W突變完全逃脫了Regeneron公司的REGN-COV2（REGN10933和REGN10987）抗體，部分關鍵突變如K417N、Y453F可能導致對抗體的逃脫[53，66］，其他研究也進一步證實部分突變株對REGN-COV2等治療性抗體存在不同程度的抗性[57，67］。針對突變株對抗體治療的漏逸能力，抗體聯合療法或研發針對相對保守抗原的特異性抗體或許是有效的解決途徑。

4.3 SARS-CoV-2突變株對預防性疫苗的影響 目前全球緊急獲批使用的新冠疫苗包括我國的國藥集團中國生物和科興中維的滅活疫苗BBIBP-CorV、美國輝瑞公司的mRNA疫苗mRNA-1273以及Bio‐tech公司的mRNA疫苗BNT162b2。SARS-CoV-2突變株的出現不僅引發研究者對其傳染性和致病性變化的關注，同時相關蛋白的突變是否對已獲批的新冠疫苗的有效性產生影響同樣引起研究者的高度關注。SHI等[68］最新的預印本研究結果顯示，20例參與者接種BNT162b2疫苗免疫產生的血清，對攜帶B.1.1.7、B.1.351突變株共有突變N501Y的病毒和未攜帶突變的N501病毒具有相似的中和活性。MUIK等[69］的研究結果同樣顯示注射BNT162b2疫苗產生的免疫血清對武漢參考株和攜帶B.1.1.7S突變的假病毒具有相同的中和效力。WANG等[70］同時對20例mRNA-1273、BNT162b2疫苗接種者接種后第八周的血清進行檢測分析，結果發現對包含K417N、E484K、N501Y三突變的假病毒中和能力降低1～3倍，從免疫血清中分離的多個單克隆抗體表現出對E484K、K417N、N501Y突變不同程度的中和活性降低。高福團隊最新的研究報告了B.1.351突變株對BBIBP-CorV滅活疫苗的影響，結果表明疫苗誘導的血清中和抗體對B.1.351突變株的50%中和效價為70.9，相比對照組的110與107略有降低，但依然有效[71］。這些結果初步表明BBIBP-CorV滅活疫苗對突變株仍具有明顯的免疫保護效應，但也提示SARS-CoV-2突變的不斷積累可能帶來潛在的免疫逃逸的風險。

5 小結

SARS-CoV-2在從發現至今的傳播中已出現大量突變的積累，其中，非同義突變或得益于自身校對機制、或歸因于不利影響而被自然選擇去除；一部分同義突變未發現對病毒的生物學特性產生影響；少部分突變具有適應性優勢而積累，逐步發展為新的突變株。盡管大部分突變未觀察到其所導致的明確的病毒傳染性和致病性的增強，但多個實驗提示一些突變的確存在增強病毒傳染性的風險，而尚無明確證據證實致病性的增強。類似水貂突變株的出現表明SARS-CoV-2可以在其他動物宿主中發生適應性突變并復制傳播，提示應當警惕病毒通過其他動物宿主再次傳染人類的潛在風險。此外，突變可能直接影響核酸檢測的準確性、敏感性，進而影響患者的臨床診斷；或直接改變病毒的抗原特性，從而影響到預防性疫苗與治療性抗體的防治效果。雖然多項研究表明已獲批使用的疫苗在突變株中依舊存在明確的免疫保護效應，但也存在一定程度的免疫逃避，因此實時監測、分析病毒突變并及時納入疫苗研發優化策略，針對突變設計出相對更為“廣譜”的疫苗顯得尤為重要。總而言之，病毒基因突變可能改變病毒的生物學特性，從而影響已有的診斷、治療和預防，對相關突變進行監測和分析有助于掌握疫情發展趨勢，及時作出更具預見性和有效性的防控措施。