載阿霉素上轉換納米顆粒體內急性毒性實驗研究

程梓荷　李科

1研究背景

隨著科學技術的進步和醫療水平的突飛猛進，許多疾病的威脅已經大大降低，然而惡性腫瘤仍為全世界嚴重危害人類健康的一大類疾病之一。據世界衛生組織國際癌癥研究中心（IARC）2020年發布的報告，2020年約996萬人死于癌癥，其中中國癌癥死亡人數約300萬，占癌癥死亡總人數30%，位居全球第一。據國家癌癥中心2019年1月發布的統計數據顯示，2015年我國總體惡性腫瘤發病率為285.83/10萬例，其中死亡率為170.05/10萬例。在過去的10余年，癌癥負擔呈持續上升態勢，惡性腫瘤發病率每年保持約3.9%的增幅，死亡率每年保持2.5%的增幅。目前臨床上惡性腫瘤的治療方式主要為放療、化療、手術治療三種，傳統的治療方法均存在不同程度的副作用，例如術后并發癥、正常細胞組織損害、免疫力低下等，可降低惡性腫瘤生存者的遠期生活質量和生存期。近年來，分子靶向治療、免疫治療等新型腫瘤治療方法的研究如火如荼，但尚未有突破性的革新。因此，急需開發一種新型高效且精準的惡性腫瘤治療方法。

上轉換納米顆粒（Upconversion Nanoparticles，UCNPs）主要由氧化物、氟化物和鹵氧化物等基質通過摻雜三價稀土離子構成，是一種低毒、穩定和發光壽命長的新型熒光探針，其避免了短波長激發光（通常為紫外線）產生自體熒光后對發射光檢測的干擾，且因為波長較長，對生物組織的穿透能力大大加強而對正常組織無侵害性，可實現深部組織非侵入式探測和治療。UCNPs還具有許多優越的性能：優異的光和物理化學穩定性;生物相容性好;激發光譜窄，檢測靈敏度高;較高的成像信/噪比;光損傷效應低;發射光穩定性好、幾乎無光漂白現象：通過摻雜不同的稀土元素產生不同的發射光，實現多色同時檢測。這些獨特的優點使UCNPs在光、電、磁及生物醫學等多個領域迅速成為研究人員關注的焦點。目前，針對UCNPs在惡性腫瘤治療與診斷方面的主要研究方向為光動力治療、光熱療法、化學聯合療法、多模成像指導的診療一體化等。其中，因UCNPs和化學藥物的聯合應用可有效提高藥物靶向性、增強化療效果，而具有更廣闊的應用前景。

阿霉素及其生物活性衍生物作為臨床上常用的抗腫瘤藥物，可以直接導致細胞DNA損傷、活性氧的產生以及細胞凋亡，對乳腺癌、白血病等多種惡性腫瘤具有良好的治療效果。但也因此不可避免地帶來一系列抗癌不良反應，如心臟毒性反應、白細胞減少、血小板減少等，這不僅限制了其在腫瘤患者中的應用，還降低了腫瘤患者的預后。為了解決這個問題，人們將目光轉向DOX與UCNPs的聯合療法，因為UCNPs不僅能實現光學成像，還可作為藥物遞送系統，實現定向給藥，提高DOX治療效果。

近些年來已有負載DOX的UCNPs對腫瘤細胞進行干預的研究報道，但尚未見體內急性毒性研究的相關報道。本研究利用制備的NaYF₄：Yb³⁺，Er³⁺@NaGdF₄@mSiO₂-FA-DOXNPs，進行BALB/c小鼠體內急性毒性實驗及病理學變化分析，以評價其安全性，可為開發惡性腫瘤治療新方法奠定理論基礎并提供實驗依據。

2研究方法

2.1材料

2.1.1動物

50只BALB/c小鼠，雌雄各半，體重（18±2）g，個體勻稱、反應靈活、皮毛濃密、眼睛光澤、鼻孔清潔、無分泌物、呼吸正常，購自北京華阜康生物科技有限公司。將小鼠維持在標準環境下，室內溫度21～25℃，相對濕度45%～55%，潔凈飲食，安靜通風清潔環境下分籠飼養，給予12h光照、12h黑暗循環。鼠籠為IVC鼠盒，鼠盒每次使用前應滅菌消毒，墊料每周更換2次，飼料和飲水每周添加、更換3～4次。動物飼養室保持清潔、干燥。所有實驗程序均經西安醫學院動物保護和使用委員會批準。

2.1.2藥品和主要試劑

D0x購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;NaYF₄：Yb³⁺，Er³⁺@NaGdF₄@mSiO₂-FA-DOX NPs由本實驗室合成;蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。

2.2方法

2.2.1分組及給藥

50只BALB/c小鼠隨機分成5組，每組10只（雌雄各半），包括1個陰性對照組（生理鹽水），1個游離DOX組（尾靜脈注射給藥，5.0mg/kg）和3個UCD NPs組（尾靜脈注射給藥，5.0mg/kg、7.5mg/kg、10mg/kg，以DOX計），給藥后連續觀察14d。

2.2.2一般體征

每天觀察小鼠的一般體征、行為運動、精神狀態和死亡等情況并記錄小鼠質量。

2.2.3主要臟器HE染色

14d后將小鼠安樂死，取出心、肝、脾、肺、腎等主要臟器，將臟器用4%多聚甲醛固定。經過修剪、脫水、透明、浸蠟、包埋后進行石蠟組織切片，切片厚度為4～6μm。HE染色時，首先用二甲苯脫去切片中的石蠟，將已人蒸餾水后的切片放人蘇木素水溶液中染色數分鐘，蒸餾水沖洗后用含1%鹽酸乙醇分化數秒，0.6%氨水返藍15min后流水沖洗，入伊紅染液染色30s，染色后的切片經脫水、透明后固定封片，用光學顯微鏡觀察。

3結果

3.1小鼠行為特征和體重變化

陰性對照組小鼠外觀體征、行為活動、攝食量均正常。游離DOX組小鼠給藥后出現懶惰、嗜睡、活動減少、厭食，立毛現象明顯，個別出現黏液便，體重下降相對較快，死亡率為80%。UCD NPs組小鼠精神狀態良好、活動自如、攝食量、糞便未見明顯異常，體重有所下降，死亡率隨DOX劑量增加而增加，死亡率依次為30%、40%和60%。

3.2小鼠各臟器病理變化

顯微鏡下觀察發現，陰性對照組小鼠各臟器組織細胞完整，核清晰可見，細胞質豐富均勻，核膜清楚，無空泡化;游離DOX組小鼠心臟可見心肌細胞有不同程度的變性、壞死，心肌結構紊亂，肌纖維部分斷裂，間隙擴大，間質內有淋巴細胞及漿細胞浸潤，呈心肌炎表現：UCD NPs組小鼠僅表現為肝臟有輕微炎癥細胞浸潤，這是因為UCD NPs通過血液循環輸送到肝臟組織中，被肝臟組織中的網狀內皮系統中的巨噬細胞吞噬，從而導致其在肝臟中蓄積，引起正常肝細胞發生炎癥反應。隨著納米顆粒逐漸被肝臟代謝，肝細胞即可恢復正常。

4討論

惡性腫瘤是我國居民死亡的主要原因之一，雖然近年來其治療取得了一定的進步，生存率有所提高，但常規療法仍存在一定局限性，療效尚不滿意。隨著納米技術和生物醫學的飛速發展，UCNPs的研究也愈發深入，其所具有的特殊的光學特性及良好的生物相容性等特點，為其構建成為抗腫瘤藥物載體提供先決條件。UCNPs與化療藥物的聯合療法便是相關研究的熱點內容之一。DOX作為一種臨床常用的化療藥物，可被負載于UCNPs，得到的納米顆粒可以降低DOX的不良反應、實現光學成像，具有廣闊的臨床研究前景。

現階段UCNPs的相關研究盡管在體外毒性方面已有一定的成果，但是在納米顆粒對動物器官的影響、納米顆粒的體內急性毒性實驗等方面仍需探索。因此，本實驗通過制備的UCD NPs主要進行BALB/c小鼠體內急性毒性實驗及主要臟器病理學變化的研究。研究結果表明，游離DOX組小鼠給藥后大多數出現活動異常，體重下降快，死亡率較高。HE染色可見明顯的毒性影響，表現為心肌纖維斷裂，細胞間隙變大，心肌細胞發生變性壞死或有炎癥細胞的浸潤等改變。而UCD NPs組小鼠生命活動基本正常，藥物毒性相對較小。UCD NPs組DOX劑量達到游離DOX組藥物劑量的兩倍時，死亡率仍低于游離DOX組;同等DOX濃度（5.0mg/kg）下，UCD NPs組的死亡率約為游離DOX組的1/3。由于納米顆粒在肝臟的暫時性蓄積，在光鏡下肝臟組織有少量炎性細胞浸潤，其他臟器結構基本正常。

綜上所述.本研究通過急性毒性實驗發現UCD NPs可有效降低DOX的毒副作用，該研究結果可為日后的惡性腫瘤治療臨床新方法提供有效的參考。