聚多巴胺納米顆粒對結直腸癌細胞光熱干預效果研究

陳融超　周連鎖

1研究背景

結直腸癌（Colorectal Cancer）是世界上最高發的癌癥類型之一，約占所有新癌癥病例的10%和所有癌癥死亡病例的8.5%。在中國，結直腸癌位居我國惡性腫瘤發病第三位，其發病率達28.2/10萬，年發病數為38.8萬例，且發病率呈上升趨勢，死亡率為13.61/10萬，年死亡數為18.7萬例，在因惡性腫瘤致死原因中排行第五。結直腸癌治療以手術為主，化療和放療為輔，但傳統的手術切除帶來的如吻合口出血、術后腸梗阻等并發癥，很大程度上增加了患者的痛苦。同時，結直腸癌術后轉移和復發的問題嚴重影響預后，轉移是結直腸癌致死的最主要原因.約有50%的患者可出現肝轉移，其中同時性肝轉移達15%～25%。

光熱治療（Photothermal Therapy，PTT）是在臨床上繼手術、放療和化療之后的新興治療手段。其作為一種新型的利用光熱轉換劑吸收光能并產熱來起到治療效果的無創腫瘤治療手段，對于治療淺表性腫瘤具有良好的效果。該治療方法最具優勢的特點是無創，引起患者全身系統性損傷小、并發癥少，光熱治療不僅能殺滅癌細胞，還可以抑制腫瘤細胞的轉移，具有精確性高、可控性強、副作用小等特點。光熱轉換劑是光熱治療中的關鍵性材料.理想光熱轉化劑應具有以下特點：（1）在近紅外光窗口（650～950nm）具有較強的吸收能力和較高的光熱轉換效率;（2）生物安全性高;（3）生物穩定性強;（4）在惡性腫瘤組織中保留時間長。其中，聚多巴胺是一種較為理想的光熱轉化劑。聚多巴胺是黑色素的主要成分，具有較廣的光譜吸收性、光熱轉化效率高、生物相容性優異，在體內可降解等特點，非常適合用于光熱治療。本研究利用聚多巴胺對結直腸癌SW480、SW620細胞進行光熱干預，以探索其對結直腸癌的治療效果。

2研究方法

2.1材料

聚多巴胺納米顆粒由本實驗室進行合成，完全培養基（DMEM高糖培養基（hyclone）、MTT、青霉素、鏈霉素、胎牛血清（FBS）均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。胎牛血清（FBS）購買于浙江天杭生物科技股份有限公司。人結直腸癌細胞SW480、SW620由空軍軍醫大學提供。

2.2 MTT法檢測聚多巴胺對SW480、SW620細胞的毒性

采用復蘇的人結直腸癌細胞SW480、SW620為樣品，在含10%胎牛血清、濃度為0.1mg/mL的青霉素和鏈霉素的DMEM培養基中進行培養，并將其放置于條件為37℃，5%CO，的無菌培養箱中進行培養，定期觀察細胞生長狀況。在細胞長至鋪滿培養皿80%以上后進行傳代。將傳代后培養36h左右的細胞用胰酶消化，以每孔1×10⁴個細胞的密度鋪入平底96孔板內，加入含有不同濃度梯度聚多巴胺納米顆粒的培養基（81，27，9，3，1μ/mL），繼續培養96h。培養結束后去除培養基，每孔重新加入200μL含有濃度為100ng/mLMTT的完全培養基，并培養4h。去除培養基后，每孔加入100mL DMSO，放置于水平振蕩儀上振蕩處理10min后利用酶標儀測定每孔在490nm處的吸光值。計算IC₅₀值。

2.3聚多巴胺光熱干預效果檢測

2.3.1不同濃度的聚多巴胺光熱劑干預效果檢測

將人結直腸癌細胞SW480、SW620鋪至24孔板，1×10⁵個/孔，分為5組，第1組為空白對照組，2～5組分別加入不同濃度的聚多巴胺光熱劑（200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL），采用照射功率為1W/cm²，激光波長為808nm的激光發射器照射處理6min。輻照完畢后繼續孵育12h，去除孔內的培養基，參照前述MTT法測定抑制率。根據前期所確定的聚多巴胺的最適藥物濃度.設置不同的輻照時長和輻照功率，間隔時長與功率分別為2min以及0.4W，以前述同樣MTT法測定并計算抑制率。

2.3.2不同輻照時間干預效果檢測

在2塊24孔板內分別均勻鋪人人結直腸癌細胞SW480、SW620，密度為1×10⁵個/孔，分為5組，第1組為空白對照組，不進行照射。第二組照射時長為1min，第三組照射時長為2min，第四組照射時長為3min，第五組照射時長為4min，第六組照射時長為5min。每孔加入1mL濃度為100μm/L的聚多巴胺光熱劑。第二至六組每孔均以808nm的激光進行照射處理，照射功率為1W/cm²。照射完畢繼續孵育12h，以前述同樣MTT法測定并計算抑制率。

2.3.3不同輻照功率干預效果檢測

在2塊24孔板內分別均勻鋪入人結直腸癌細胞SW480、SW620，密度為1×10⁵個/孔，分為5組。設置第1組為空白對照，第2～6組輻照功率分別為0.2w/cm²、0.6W/cm²、1.0W/cm²、1.4W/cm²、1.8w/cm²。每孔加入1mL含有100μg聚多巴胺光熱劑的無色培養基。使用波長為808nm的激光發射器，在上述不同功率下對第2～6組進行2min的照射處理。處理后放回培養箱孵育12h，以前述同樣MTT法測定并計算抑制率。

3結果

3.1聚多巴胺對SW480、SW620細胞增殖的抑制效果

聚多巴胺針對SW480、SW620細胞未顯示出抑制效果，其在SW480、SW620細胞上的IC₅₀值均超過500μg/mL。表明了聚多巴胺在非光照條件下具有毒性低的特點，生物安全性高。

3.2聚多巴胺對SW480、SW620細胞的光熱干預效果

在同等光照功率和時長下，聚多巴胺的濃度越高，細胞存活率越低。最高濃度處理組細胞存活率低于10%，最低濃度組70%細胞存活，同等藥物濃度和光熱下SW480、SW620細胞存活率未顯示出顯著的差異。該結果證明了細胞存活率與聚多巴胺納米粒子濃度之間存在著顯著的量效關系，表明了聚多巴胺具有較好的光熱轉換特性.能將光能很好的轉化為熱能。并且其發熱抑制腫瘤效果明顯，對細胞殺傷作用隨濃度的升高而增大。

根據前面結果，選出100μg/mL的聚多巴胺進行光輻射時長測試。細胞存活率與光輻射時長之間存在著顯著的量效關系，光輻射時長越長，細胞存活率越低。照射10min后細胞僅有9.7%的存活率，且狀態很差。同等條件下僅進行光輻射的SW480、SW620細胞存活率沒有顯示出顯著的差異。隨時間的增加，聚多巴胺能更好地將吸收的光能轉化為熱能，從而進行細胞殺傷。

細胞存活率隨著光輻照功率的增加在一定范圍內逐漸降低，超過1.4W/cm²后未發現顯著存活率差異。

4討論

目前結直腸癌多采用手術、化療和放療等進行綜合性治療，但這些治療方法均有其局限性。手術具有較大的損傷性，術后并發癥以及肝轉移對患者存在著較大的威脅，其中，轉移病灶切除不徹底、只能行姑息性輔助化療等情況依舊存在：而化療效果則受毒性和耐藥性所限制;外放射療法在初次進行手術后可有效降低其復發率，但行肝切除術后，受個體差異以及放射劑量等因素影響，肝臟仍可產生如腹水、肝大等并發癥，導致患者預后較差，生活質量較低等問題。納米材料介導的光熱治療已成為一些不可切除的實體瘤的替代療法，其作為一種無創的治療手段，具有明顯的腫瘤治療優勢，較強的可控制性可以降低系統毒性并極大減少對正常組織的損傷，可極大地減少患者的痛苦，提高生活質量。多巴胺作為黑色素的組成成分在人體內大量存在，而聚多巴胺納米顆粒是人工合成黑色素樣納米顆粒的出色代表，其安全性和光熱轉換效能已被廣泛認可。利用聚多巴胺納米顆粒進行光熱治療，在腫瘤治療方面具有廣闊的臨床研究前景。

本實驗通過制備的聚多巴胺納米顆粒對結直腸癌細胞進行光熱干預研究。研究結果表明，聚多巴胺可有效抑制結直腸癌細胞SW480、SW620的增殖。聚多巴胺納米顆粒在非光熱照射條件下毒性極低，而在光熱照射條件下顯示出對細胞的殺傷作用，且光熱殺傷效果隨時問和聚多巴胺納米粒子濃度的升高而增加，合適的光輻射時間和藥物濃度可使聚多巴胺將所吸收的光能充分轉化成可殺傷腫瘤細胞的有效熱能。實驗表明聚多巴胺對結直腸癌有明顯的干預效果，并且充分展示了聚多巴胺的高生物安全性、高光熱轉化能力、高光熱轉化效率以及可控性，該研究結果可為日后的結直腸癌臨床治療新方法提供有效的參考。