雙酚A 對PK-15 豬腎細胞DNA 損傷和細胞凋亡的影響

張 卓，孔艷彪，高斌戰(zhàn)，宋寶敏，趙 婷，袁建琴

（1.山西農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，山西太谷 030801；2.山西省獸用生物制品試驗推廣中心，山西太谷 030800）

雙酚A（Bisphenol A，BPA）是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物[1-2]，在化學工業(yè)產(chǎn)品中使用十分廣泛，主要用來生產(chǎn)聚碳酸酯和環(huán)氧樹脂塑料，并廣泛用于制造人們生活中經(jīng)常接觸到的物品，如食品罐、奶瓶和飲料容器等[2-5]。在惡劣的環(huán)境下，如高溫、酸或堿等條件下，這些塑料制品中的BPA 會釋放，并滲入到環(huán)境中[1，6]。目前，在人的羊水、血液、母乳、胎盤、汗液和尿液中都檢測到BPA，在許多其他生物中也可檢測到BPA[6-7]。環(huán)境污染可影響人的社會行為、焦慮水平、神經(jīng)功能及神經(jīng)遞質(zhì)含量等[1，6]。越來越多的研究表明，BPA 與動物健康異常有關(guān)，表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)和肝臟內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)的改變、精子質(zhì)量和數(shù)量指數(shù)性下降、神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂、糖尿病、心臟病、肥胖癥以及惡性腫瘤等疾病[1，8-12]，并發(fā)現(xiàn)BPA 可通過不同的作用機制發(fā)揮其毒性效應(yīng)[8-10，13-15]。單細胞凝膠電泳又稱彗星試驗，是一種在單細胞水平上檢測DNA 鏈損傷的方法，目前已成為全球研究熱點[16-17]。

健康的腎臟對機體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和正常代謝是必不可少的。在病理狀態(tài)下，多種因素在慢性腎病患者體內(nèi)積聚，導(dǎo)致尿毒癥和死亡率增加，以及包括虛弱、厭食、嘔吐、睡眠障礙、神經(jīng)病變、心血管疾病和進行性腎功能喪失在內(nèi)的癥狀。因此，尿液毒素的清除伴隨著臨床癥狀的改善[18-20]。HUANG等[21]研究表明，氧化應(yīng)激是BPA 毒性的一種基本機制。也有研究表明，BPA 可通過降低HepG2 細胞內(nèi)超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性，提高活性氧（Reactive oxygen species，ROS）水平以及硫代巴比妥酸反應(yīng)物（Thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）含量誘導(dǎo)細胞氧化應(yīng)激[22]。ROS也會導(dǎo)致DNA 損傷[23]。在患不育癥的男性中，接觸BPA 有可能對精子DNA 的完整性和精子質(zhì)量造成潛在損害[24]。受損的DNA 可影響細胞功能，導(dǎo)致癌癥和各種慢性病疾病[25]。最近的研究表明，BPA 在細胞凋亡、增殖和遷移過程中具有毒性作用[6，26]。YUAN 等[26]證實了暴露于BPA 的Marc-145 細胞系中凋亡細胞和細胞核的數(shù)量明顯高于Marc-145 細胞系對照組，表明BPA 可更加特異的影響Marc-145細胞凋亡，同時BPA 誘導(dǎo)的細胞凋亡可能與Marc-145 細胞炎癥損傷有關(guān)。然而，目前有關(guān)BPA暴露對腎臟系統(tǒng)的毒性影響研究很少。

為了探究BPA 的腎毒性作用機制，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上選擇10-3～10-6mol/L BPA[26]進行PK-15 豬腎細胞單細胞凝膠電泳試驗和Hochest 細胞凋亡檢測，分析BPA 對PK-15 豬腎細胞DNA 損傷和細胞凋亡的影響，為探討B(tài)PA 對豬腎細胞損傷的可能作用途徑，研究BPA 的腎毒性作用機制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細胞系 PK-15 豬腎細胞系，由山西隆克爾生物制藥有限公司提供。

1.1.2 主要試劑 BPA 為上海阿拉丁生化科技股份有限公司產(chǎn)品（將2.282 9 g BPA 溶于10 mL 二甲基亞砜（DSMO，北京索萊寶公司提供），制成1 mol/L BPA 溶液，經(jīng)0.22 μm 濾器過濾除菌后貯存于4 ℃冰箱備用。試驗當天制備從1×10-6mol/L 到1×10-3mol/L 的BPA 稀釋液）；胎牛血清、正常熔點瓊脂糖、低熔點瓊脂糖、肌氨酸鈉、溴化乙錠、Triton-X-100、雙抗和Hoechst 33342 染料（即用型）購自北京索萊寶科技有限公司。MEM液體培養(yǎng)基由北京通正生物技術(shù)有限公司提供。其他試劑均為分析純，由山西農(nóng)業(yè)大學生命科學學院細胞生物學實驗室提供。

1.2 試驗方法

PK-15 豬腎細胞在含有6%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的MEM 中于5%二氧化碳培養(yǎng)箱中37 ℃孵育培養(yǎng)48 h。對照組為上述配方下含有0.1%DMSO 的PK-15 豬腎細胞MEM培養(yǎng)液。在相同條件下，所有試驗都為6 個重復(fù)。

1.3 DNA 損傷檢測

分別向每組PK-15 豬腎細胞培養(yǎng)瓶中接入2 mL 不同濃度梯度的BPA（分別含BPA 10-3、10-4、10-5、10-6mol/L）的MEM 液體（含3%胎牛血清和100 U/mL 的雙抗），繼續(xù)在37 ℃5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)PK-15 豬腎細胞。24 h 后，倒掉培養(yǎng)瓶中液體，分別向?qū)φ战M和BPA 攻毒組加入2 mL 的細胞分散液，消化約3 min，倒掉分散液。取5 mL（含3%胎牛血清）MEM培養(yǎng)液將細胞吹散開，然后吸取0.5 mL 細胞懸液置于1.5 mL 離心管中，貼好標簽，放于4 ℃冰箱中備用。

1.3.1 三明治膠板的制備 第1 層凝膠的制備：取80 μL 保存于56 ℃正常熔點瓊脂糖（0.5%）滴在磨砂載玻片的中心處，拿一片蓋玻片從左到右緩慢放下，使蓋玻片下的膠體內(nèi)無氣泡，4 ℃下凝固10 min；第2 層凝膠的制備：取事先配好的保存于37 ℃的低熔點瓊脂糖（0.5%）75 μL 加入10 μL 含有不同濃度梯度的BPA 細胞懸液（105個/mL），用移液槍緩慢吸打混勻，取適量細胞懸液滴在第1 層凝膠上，放置蓋玻片，4 ℃下凝固10 min；第3 層凝膠的制備：取85 μL 37 ℃預(yù)熱的低熔點瓊脂糖（0.5%）滴在已經(jīng)制備好的第2 層凝膠上，蓋上蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡，4 ℃下凝固10 min。

1.3.2 裂解PK-15 豬腎細胞 將完全凝固的載玻片放入4 ℃預(yù)冷的細胞裂解液中，在4 ℃下裂解3 h 左右（注意：細胞裂解液臨用前再加入1%體積的Triton-X-100 和10%的DMSO）。

1.3.3 堿解旋 3 h 后，取出三明治膠板，PBS 反復(fù)沖洗后晾干。把晾干后的三明治膠板水平置于凝膠電泳槽陽極端，向電泳槽中緩慢倒入4 ℃預(yù)冷的堿性電泳緩沖液，堿解旋20 min（注意：堿性電泳緩沖液液面要在膠板上方0.25 cm 左右）。

1.3.4 電泳與染色 常溫下，膠板在25 V、30 mA下電泳20 min。電泳結(jié)束后，將載玻片按照從高到低的BPA 濃度放入托盤中，向托盤中緩慢倒入4 ℃預(yù)冷的Tris-HCl 中和液，待液體完全浸沒膠板后中和15 min。最后在膠板上懸空滴入適量的30 μg/mL的EB 染色液，暗室染色10 min，并立即在熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.4 細胞凋亡評估

為了評估BPA 誘導(dǎo)的細胞凋亡情況，將PK-15豬腎細胞以密度為1×105個/孔接種在96 孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)48 h，將細胞暴露于10-3、10-4、10-5、10-6mol/L 的BPA 中24 h。然后，用PBS 清洗并用-20 ℃預(yù)冷丙酮固定30 min，再用PBS 清洗。之后，將100 μL Hoechst 33342 染料（2 mg/mL）加入培養(yǎng)基中，37 ℃孵育5 min。在熒光顯微鏡下，統(tǒng)計3 個不同區(qū)域出現(xiàn)高度凝聚（濃縮）或碎裂的PK-15 豬腎細胞核。共檢測了200 個PK-15 豬腎細胞并計算各組細胞凋亡百分率。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)都以平均值±標準誤表示。采用彗星分析軟件1.2.2（Comet Assay Software Project，CASP）對每張載玻片25 個隨機選擇的非重疊細胞進行顯微鏡下檢測和分析。使用GraphPad Prism 5.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析檢測處理組之間的差異，之后用Turkey's 多重比較作為事后檢驗。P＜0.05 被認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 BPA 對PK-15 豬腎細胞彗星細胞率的影響

每張載玻片隨機選25 個細胞，計數(shù)彗星（拖尾）細胞數(shù)并計算彗星細胞率。試驗結(jié)果顯示，4 個BPA處理組（10-3、10-4、10-5、10-6mol/L）PK-15 豬腎細胞的彗星細胞率分別為93.10%±2.22%、81.05%±4.91%、61.02%±4.01%、38.99%±3.59%，均比對照組的彗星細胞率（20.19%±1.98%）極顯著提高（P＜0.01），并且隨著BPA 濃度的升高，彗星細胞率顯著增加（圖1）。

2.2 BPA 對PK-15 豬腎細胞拖尾長度 （尾長）的影響

對PK-15 豬腎細胞在標準條件下進行堿性單細胞凝膠電泳，圖2 為BPA 誘導(dǎo)PK-15 豬腎細胞典型的彗星結(jié)構(gòu)圖像和DNA 單鏈斷裂情況。彗星細胞的典型圖像清楚地顯示，隨著BPA 劑量的增加，從彗星頭部釋放出來的DNA 斷裂程度增加（圖2）；且隨著BPA 濃度（10-3、10-4、10-5、10-6mol/L）的減小，PK-15 豬腎彗星細胞尾長縮短，分別為（57.86±2.21）μm、（41.01 ±4.13）μm、（33.02 ±3.79）μm、（23.66±3.94）μm，與對照組相比（尾長為（11.61±3.12）μm）差異顯著（P＜0.01）（圖3）。

2.3 BPA 對PK-15 豬腎細胞尾部DNA 含量的影響

采用Comet Assay Software Project（CASP）1.2.2和GraphPad Prism 5.0 軟件對對照組以及10-3～10-6mol/LBPA 處理的試驗組進行了PK-15 豬腎細胞彗星細胞尾部DNA 百分含量分析。由圖4 可知，與對照組尾部DNA 百分含量（2.04%±0.62%）相比，不同濃度BPA（10-3、10-4、10-5、10-6mol/L）激發(fā)的PK-15 豬腎細胞彗星細胞尾部DNA 百分含量分別為39.59%±2.81%、27.68%±1.92%、16.03%±1.09%、8.41%±0.64%，呈劑量依賴性升高，均極顯著高于對照組（P＜0.01）。

2.4 BPA 對PK-15 豬腎細胞尾矩的影響

尾矩是彗星細胞尾長與細胞尾部DNA 百分含量的乘積。在細胞高度損傷劑量下，尾矩與細胞損傷程度呈線性關(guān)系。從圖5 可以看出，10-3、10-4、10-5、10-6mol/L BPA 處理的PK-15 豬腎細胞尾矩分別為23.11±1.49、11.52±0.78、5.14±1.36、1.96±0.79，與對照組（0.21±0.12）相比差異極顯著（P＜0.01），并且隨著BPA 濃度的降低，尾矩下降，相應(yīng)的細胞損傷程度下降。

2.5 BPA 誘導(dǎo)PK-15 豬腎細胞的細胞凋亡

凋亡細胞出現(xiàn)萎縮或凝聚的細胞核。從圖6 可以看出，對照組中幾乎沒有凋亡的PK-15 豬腎細胞。由圖7 可知，暴露于不同濃度（10-3、10-4、10-5、10-6mol/L）BPA 的PK-15 豬腎細胞凋亡率隨著BPA濃度的升高而升高，BPA 暴露組PK-15 豬腎細胞細胞凋亡呈劑量依賴性增加（P＜0.01）。

3 結(jié)論與討論

BPA 被廣泛用于生產(chǎn)環(huán)氧樹脂和聚碳酸酯塑料。在惡劣的環(huán)境下，這些塑料可能會釋放可滲入環(huán)境的BPA，但是，關(guān)于BPA 對動物慢性腎病的有害影響及其作用機制的報道很少。通過研究得知，隨著BPA 濃度的升高，PK-15 豬腎細胞細胞核DNA 損傷增強；彗星細胞率、彗星細胞DNA 尾長、細胞尾部DNA 百分含量和尾矩均比對照組顯著提高。表明隨著BPA 濃度的升高，相應(yīng)的細胞核DNA損傷程度也在加劇。研究結(jié)果也證實了，暴露于BPA的PK-15 豬腎細胞凋亡細胞的數(shù)量明顯高于對照組，表明BPA 可特異地誘發(fā)PK-15 豬腎細胞凋亡，即暴露于BPA 可誘導(dǎo)PK-15 豬腎細胞DNA 損傷和細胞凋亡。

彗星試驗是一種檢測單細胞中DNA 鏈斷裂的電泳技術(shù)。由于其簡便、快速、靈敏、無需放射免疫和檢測細胞數(shù)量少等優(yōu)點，適用于不同類型的體內(nèi)外試驗和各種類型的細胞DNA 損傷研究。通常，細胞核的DNA 分子量很大，是一種超螺旋結(jié)構(gòu)，并且附著在細胞核的基質(zhì)中[16，26]。用正常熔點瓊脂糖和低熔點瓊脂糖凝膠呈三明治夾心法將PK-15 豬腎細胞包埋在磨砂的載玻片上，在堿性裂解液的作用下，細胞膜和核膜被破壞，使PK-15 豬腎細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、RNA 以及其他成分進入瓊脂糖凝膠，并進一步擴散到堿性裂解液中，只有PK-15 豬腎細胞的細胞核DNA 仍然附著在其核骨架上且留在原位。若PK-15 豬腎細胞未受到BPA 損傷，電泳時細胞核DNA 就會因其分子量較大而留在PK-15 豬腎細胞細胞核基質(zhì)中，經(jīng)EB 染色后呈現(xiàn)圓形的橘紅色熒光團，無彗星拖尾現(xiàn)象；若PK-15 豬腎細胞受到BPA 損傷，則在堿性的凝膠電泳液中，首先是PK-15 豬腎細胞核DNA 雙鏈解螺旋成為單鏈，之后單鏈斷裂的碎片因其分子量較小可進入瓊脂糖凝膠中，在凝膠電泳時斷裂或碎片DNA 離開PK-15 豬腎細胞核DNA 向陽極遷移，并形成拖尾。PK-15 豬腎細胞受到BPA 損傷愈嚴重，細胞核DNA 損傷也愈嚴重，產(chǎn)生的DNA 斷鏈愈多，其短片段或斷鏈也就愈小，在凝膠電泳電場作用下遷移的PK-15 豬腎細胞細胞核DNA 的百分含量越高，遷移的距離也越長，表現(xiàn)為PK-15 豬腎細胞核DNA 尾長增加和尾部橘紅色熒光強度增強。因此，通過測定PK-15 豬腎細胞核中DNA 的彗星細胞率、尾長、尾部DNA 百分含量和尾矩就可定量測定單個PK-15 豬腎細胞DNA 的損傷程度。

在本研究中，BPA 可引起嚴重的PK-15 豬腎細胞DNA 片段損傷和明顯的拖尾，隨著BPA 濃度的升高，可發(fā)現(xiàn)DNA 損傷增強，彗星細胞率、尾長、彗星細胞尾部DNA 和尾矩增加，可能的原因是BPA 通過提高氧化應(yīng)激損傷和抑制DNA 損傷的修復(fù)途徑影響了PK-15 豬腎細胞核DNA 雙鏈的穩(wěn)定性。

此外，BPA 可誘導(dǎo)組織細胞內(nèi)自由基含量增多，造成脂質(zhì)過氧化程度加劇，抗氧化酶（SOD）活性和谷胱甘肽（Glutathione，GSH）的產(chǎn)量降低[26]。組織細胞內(nèi)自由基增多，可促使細胞中的多種物質(zhì)發(fā)生氧化，進一步影響細胞內(nèi)生物酶的活性，導(dǎo)致細胞凋亡率增加。所以，自由基產(chǎn)生增加與BPA 毒性密切相關(guān)，是BPA 損傷組織細胞的中心環(huán)節(jié)。

在本研究中，隨著BPA 濃度的升高，自由基直接作用于核酸，引起核內(nèi)DNA 雙鏈斷裂程度增加，進而引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用而造成DNA 鏈損傷增強，出現(xiàn)明顯的拖尾現(xiàn)象，彗星細胞率、尾長、彗星細胞尾部DNA 百分含量、尾矩和細胞凋亡率增加，說明暴露于BPA 細胞的遺傳毒性是不容忽視的。

綜上所述，本研究選擇4 個不同濃度BPA（10-3、10-4、10-5、10-6mol/L）處理PK-15 豬腎細胞，24 h 后進行單細胞凝膠電泳和Hoechst 細胞凋亡檢測和分析，發(fā)現(xiàn)隨著BPA 濃度的升高，豬腎細胞DNA 損傷和細胞凋亡加劇。本研究為BPA 對動物腎臟的毒性作用研究提供了一定的信息，下一步實驗室將進行BPA 對小鼠腎臟的影響及分子損傷機制研究。