艾灰黃酮超聲提取工藝的優化及其抑菌活性

王慧芳， 程葉新， 白金虎， 王文瑞， 孟戎茜， 辛先榮， 趙潤柱， 張恒慧

(1.太原工業學院化學與化工系，山西 太原 030008；2.太原工業學院環境與安全工程系，山西 太原 030008)

艾葉中主要含有揮發油、黃酮、鞣質、多糖等有效成分，具有溫經、止血、散寒、去濕、止咳、消炎、抗過敏等多種功效[1-2]，將其曬干搗碎得艾絨后制成艾條，可供艾灸用，它通過溫熱刺激來使局部皮膚充血，毛細血管擴張，促進炎癥、粘連、血腫等病理產物消散吸收，起到行氣通絡、扶陽固脫、提高人體免疫力等作用，是中醫傳統防病治病方法[3-5]。

黃酮是一類擁有提高機體免疫力、防治心血管疾病等多種生理活性的化合物，有著廣泛的抗氧化、抑菌活性[6-8]，艾絨中也有大量該類成分[9]。艾灸產物有煙霧和灰燼，人們對前者研究較多[10-13]，而鮮有涉及后者，文獻[14-15]報道，艾灰在醫療保健方面有著廣泛的用途，如治療腳氣、褥瘡、瘡瘍出血等，其止血、清除自由基效果較艾葉更強。課題組前期對灸灰中有效成分進行提取后，發現其中仍有部分黃酮，其原因可能是艾灸過程中艾絨燃燒不充分所致。為進一步研究艾灸產物生物活性，本實驗采用超聲法提取艾灰黃酮，優化其提取工藝，并測試其粗提液、發酵液對3種革蘭氏菌的抑制作用，以期為相關產物的開發利用提供依據。

1 材料

艾絨(陳艾)購自華夏艾灸網，經山西中醫藥大學裴香萍副教授鑒定為正品。蘆丁對照品(純度>98%，編號PL-001X)購自中國計量院標準物質中心；茶多酚(純度>98%，編號JP-0263)對照品購自今品化學技術(上海)有限公司。JP-030S型超聲波清洗器購自深圳潔盟清洗設備有限公司；VIS-7220型光度計購自成都科析電子商務有限公司；LRH-150型恒溫培養箱購自山東博科科學儀器有限公司；R-3001電動升降旋轉蒸發儀購自鄭州長城科工貿有限公司。大腸桿菌(CGMCC 44568)、枯草芽孢桿菌(CGMCC 10089)來源于中微保管理中心；金黃色葡萄球菌株(CGMCC 26085)來源于中醫保管理中心。安琪高活性酵母粉(安琪酵母股份有限公司)。無水乙醇、濃鹽酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氯化鈉、氫氧化鈉等為分析純(天津化學試劑廠)。

2 方法與結果

2.1 艾灰黃酮提取及其發酵液制備 將艾絨點燃，模擬艾灸的情景暗火燃燒后得艾灰，稱取1 g，加入一定量乙醇，超聲處理一段時間后水浴加熱浸提1 h，2 000 r/min離心10 min，取上層清液，在50～55 ℃下蒸出溶劑后得濃縮液，室溫下晾干冷藏。在上述提取液(濃縮前)中加入0.1 g酵母粉，于30 ℃恒溫箱中發酵16 h，即得發酵液，冷藏備用。

2.2 艾灰黃酮含量測定

2.2.1 線性關系考察 按文獻[16]報道的方法，以蘆丁質量濃度為橫坐標(X)，吸光度為縱坐標(A)進行回歸，得方程為A=13.26X+0.004 500(R2=0.992 8)，在0～0.040 00 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.2.3 穩定性試驗 按文獻[17]報道的方法配制0.100 0 mg/mL蘆丁對照品溶液，靜置0、2、4、6、8、10 h后按“2.2.1”項下方法測定吸光度，測得其RSD為0.164 0%，表明溶液在10 h內穩定性良好。

2.2.4 精密度試驗 取0.100 0 mg/L蘆丁對照品溶液，按“2.2.1”項下方法連續測定吸光度6次，測得其RSD為0.634 0%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 加樣回收率試驗 取9份0.032 40 mg/L艾灰粗提液(或發酵液)各10 mL，加入0.045 20、0.032 40、0.021 70 mg/L蘆丁對照品溶液各10 mL，75%乙醇定容至50 mL，按“2.2.1”項下方法測定吸光度，測得其平均加樣回收率為100.267%，RSD為1.260%。

2.3 單因素試驗

2.3.1 乙醇體積分數 取艾灰1 g，設定液料比為30∶1，乙醇體積分數分別為30%、40%、50%、60%、70%，超聲振蕩30 min，在80 ℃恒溫水浴中提取1 h，離心，取上層清液，定容至100 mL，按“2.2.1”項下方法測定吸光度，計算提取率，結果見圖1。由此可知，提取率隨著乙醇體積分數增加而升高，其原因是黃酮極性與乙醇相當，后者體積分數增大有利于前者溶出，在70%時最高，為0.700 0%；但乙醇體積分數進一步增大時，艾灰中親脂性成分也會隨之溶出，導致提取率反而降低。因此，確定乙醇體積分數為70%。

圖1 乙醇體積分數對提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction rate

2.3.2 液料比 取艾灰1 g，設定乙醇體積分數為70%，液料比分別為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1，超聲振蕩30 min，在80 ℃恒溫水浴中提取1 h，離心，取上層清液，定容至100 mL，按“2.2.1”項下方法測定吸光度，計算提取率，結果見圖2。由此可知，隨著乙醇用量增加，艾灰浸潤程度逐漸加強，溶劑傳質作用提升[18]，從而使艾灰黃酮釋放量升高，液料比為30∶1時最高；但乙醇用量進一步增加時，脂溶性雜質也會隨之溶出，導致黃酮提取率降低。因此，確定液料比為30∶1。

圖2 液料比對提取率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on extraction rate

2.3.3 超聲時間 取艾灰1 g，設定乙醇體積分數為70%，液料比為30∶1，超聲時間分別為15、20、25、30、35、40 min，在80 ℃恒溫水浴中提取1 h，離心，取上層清液，定容至100 mL，按“2.2.1”項下方法測定吸光度，計算提取率，結果見圖3。由此可知，當超聲時間在15～30 min時，提取率隨著超聲時間延長而升高，在30 min時達到最高，其原因是超聲波具有較強的聲沖流和聲空化作用，能加速細胞壁的破碎[19]，從而使黃酮溶出率增大；但超聲時間進一步延長時，雜質溶出量也會隨細胞壁破碎度的增加而升高，導致黃酮提取率降低。因此，確定超聲時間為30 min。

圖3 超聲時間對提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasound time on extraction rate

2.3.4 水浴溫度 取艾灰1 g，設定乙醇體積分數為70%，液料比為30∶1，超聲時間為30 min，水浴溫度分別為40、50、60、70、80、90 ℃，恒溫提取1 h，離心，取上層清液，定容至100 mL，按“2.2.1”項下方法測定吸光度，計算提取率，結果見圖4。由此可知，水浴溫度在40～70 ℃時黃酮提取率隨著其增加而升高，在70 ℃時達到最高，為1.037%；但水浴溫度進一步升高時，黃酮結構會被破壞[20]，導致黃酮提取率降低。因此，確定水浴溫度為70 ℃。

圖4 水浴溫度對提取率的影響Fig.4 Effect of water bath temperature on extraction rate

2.4 響應面法優化 單因素試驗結果表明，水浴溫度(A)、液料比(B)、乙醇體積分數(C)對艾灰黃酮提取率(Y)的影響較大，故選擇三者進行響應面試驗，因素水平見表1，結果見表2。

表1 因素水平

表2 試驗設計與結果

表3 方差分析

響應面圖反映了各因素對響應值的影響程度，而等高線反映了其相互作用強度[21]。圖5顯示，液料比、水浴溫度曲線較陡，即對響應值的影響較大；乙醇體積分數的響應面曲線則相對平緩，即對響應值的影響較小；水浴溫度、乙醇體積分數等高線的兩兩交互作用較顯著，曲線呈橢圓形，而其余等高線接近圓形，即兩兩交互作用不顯著。

圖5 各因素響應面圖Fig.5 Response surface plots for various factors

結果表明，最優提取條件為水浴溫度84.36 ℃，液料比48.51∶1，乙醇體積分數30.22%，艾灰黃酮提取率1.105%，根據實際情況，將其修正為水浴溫度85 ℃，液料比50∶1，乙醇體積分數30%。再進行3次驗證試驗，測得艾灰黃酮平均提取率為1.092%，與預測值1.105%的偏差僅為0.013 00%，表明模型穩定可靠，擬合度良好。

2.5 抑菌活性實驗

2.5.1 藥液制備 將0.001 000 g酵母加到10 mL 0.100 0 g/mL提取液中，于28 ℃下恒溫培養48 h后得發酵液，冷藏。50%乙醇配制艾灰黃酮粗提物、發酵液、蘆丁、茶多酚供試液(0.100 0 g/mL)，采用二倍稀釋法，蒸餾水稀釋至20.00～1.560、10.00～1.250 mg/mL，即得。

2.5.2 菌種擴培與含菌培養基制備 被測菌株按文獻[23]報道的方法擴培，吸取1×108CFU/mL菌懸液1 mL至BPDA培養基中，涂布均勻，于30 ℃恒溫箱中培養1 h，即得。

2.5.3 抑菌實驗 將相同直徑的濾紙片在供試液中浸泡15 min后，均勻放置在含菌培養皿中(每皿3個，分別為無菌水、艾灰黃酮粗提液及同濃度發酵液)，同一溫度下培養72 h后觀察，平行3次，取平均值，計算抑菌圈直徑，公式為抑菌圈直徑=抑菌圈外徑-濾紙片直徑。再移取菌懸液0.100 0 mL、不同質量濃度被測液各1 mL，加到滅菌冷卻后的培養基上，涂布均勻后恒溫培養，觀察不同條件下菌落生長情況，以粗提液、發酵液不長菌的最低質量濃度為最低抑菌濃度(MIC)[24]。

2.5.4 統計學分析 采用Origin 8.0軟件處理數據，再通過SPASS 17.0軟件進行統計學分析。

2.5.5 結果分析 表4～5顯示，發酵液對3種細菌的抑制作用均強于粗提液，其中粗提液對大腸桿菌的抑制作用最強，對金黃色葡萄球菌最弱，并均弱于茶多酚、蘆丁；發酵液在高質量濃度(10.00 mg/mL)下對枯草芽孢桿菌的抑制作用最強，而低質量濃度(2.500～5.000 mg/mL)時對金黃色葡萄球菌的抑制作用較強；當發酵液質量濃度為5.000 mg/mL時，對金黃色葡萄球菌的抑制作用強于蘆丁，而為2.500 mg/mL時對3種細菌的抑制作用均強于茶多酚、蘆丁。

表4 3種細菌MIC測定結果

表5 3種細菌抑菌圈直徑測定結果

3 討論與結論

艾灰黃酮最佳超聲提取工藝為乙醇體積分數30%，液料比50∶1，超聲振蕩30 min后在85 ℃恒溫水浴中提取1 h，提取率為1.092%，與預測值(1.105%)偏差僅為0.013 00%，表明模型擬合度良好。

抑菌活性實驗結果表明，艾灰黃酮粗提液、發酵液均對待測菌株有一定抑制作用，并且后者明顯更強，其原因可能是發酵有利于該成分含量的提升[25]；發酵液抑菌效果受藥液濃度的影響較小，在2.500 mg/mL時的作用與對照藥蘆丁、茶多酚在5.000 mg/mL時的相當，可見發酵對提高其活性非常有效，以發酵液代替提取液可有效降低藥液使用量。值得注意的是，發酵液中黃酮含量會因發酵條件不同而發生變化[26]，故后期應對上述方面進行更深入的探究。