P2X4受體介導小膠質細胞促進腸易激綜合征內臟痛脊髓中樞敏化及大建中湯干預作用

武 靜， 王 慧， 楊 毅， 李堯鋒， 王俊霞， 楊莎莎

(1.貴州中醫藥大學基礎醫學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州中醫藥大學第一附屬醫院五官科，貴州 貴陽 550002)

腸易激綜合征(irriTab.bowel syndrome，IBS)是以反復腹痛為主要發病特征的功能性胃腸道疾病[1]。以往學者對IBS內臟痛的研究多集中在神經元[2]，而忽視了在神經系統中也發揮重要作用的小膠質細胞。課題組前期研究發現大建中湯可以降低內臟高敏感，從而減輕腹痛[3-4]。本次實驗通過觀察大鼠脊髓腰骶段BDNF蛋白，及ox42和P2X4受體表達情況，進而揭示大建中湯治療IBS內臟痛的神經調劑機制，為IBS內臟痛的藥物治療提供新的作用靶點和治療方向。

1 材料

1.1 藥物 大建中湯中的蜀椒、干姜、人參由貴州中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科提供，經貴州中醫藥大學汪毅教授鑒定為正品。按《金匱要略》原方，蜀椒二兩(6 g)、干姜四兩(12 g)、人參二兩(6 g)，配伍后制成1.5 g/mL質量濃度的水浸液；匹維溴銨片(美國Mylan Laboratories SAS公司，批號H20160396，規格50 mg/片)；佐劑液態鋁(美國Pierce公司，批號QD218415A)；卵清白蛋白(OVA，美國Sigma公司，批號052K1275)。

1.2 動物 SPF級SD大鼠，雌鼠12只，雄性6只，體質量150～170 g，由達碩生物科技有限公司提供，實驗動物使用許可證號SYXK(川)2013-24。自由飲食1周后，為使雌鼠有效懷孕，分別將2只雌鼠和1只雄鼠放在一籠，雌鼠懷孕后再分開喂養。待乳鼠出生后，選擇體質量為(6.42±0.57)g的48只雄性未斷乳乳鼠作為實驗對象。

1.3 試劑 注射用戊巴比妥鈉(美國SCRC公司，批號WS20060401，規格0.5 g)；ox42(英國Abcam公司)，二步法免疫組化試劑盒(北京中杉金橋公司，PV-6001、PV-6002)，DAB顯色劑(北京博奧森有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，批號P0009)；預染蛋白Marker(美國Thermofisher公司，批號26617)；底物化學發光(ECL)試劑盒(美國Affinity公司，批號KF001)；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美國Hybond公司)；聚丙烯酰胺電泳(PAGE)凝膠快速制備試劑盒(上海雅酶生物科技有限公司，批號PG112)；大鼠P2X4、BDNF多克隆抗體和生物素化山羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)(H+L)[艾博抗(上海)貿易有限公司，批號ab59246、ab5079]；兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體(上海研謹生物科技有限公司，批號GXP199629)。無水乙醇(江蘇海興化工有限公司，批號GB678-90)，PBS磷酸鹽緩沖液(北京中杉金橋生物技術有限公司，批號ZLI-9062)；蒸餾水自制。

1.4 儀器 電熱蒸餾水器(武漢格萊莫檢測設備有限公司，型號HS.Z68.5)；垂直電泳槽(北京君意東方電泳設備有限公司，型號JY-JX5L)；電泳儀(北京六一生物科技有限公司，型號DYCZ-25E)；石蠟切片機(德國萊卡公司，型號RM2135)；恒溫水浴鍋(上海勝衛電子科技有限公司，型號J-HH-4A)；光學顯微鏡(日本Nikon公司，型號80i)；圖片成像系統(美國Bio-Rad公司，型號MIAS2000)。

2 方法

2.1 分組與給藥 將48只雄性未斷乳乳鼠喂養第2天隨機分為6組，每組8只，分別為正常對照組、模型組、匹維溴銨組(陽性對照，根據文獻[5]方法設置劑量為0.045 g/kg)和大建中湯高、中、低劑量組(10.8、5.4、2.7 g/kg，分別根據人每千克體質量臨床用量的14、7、3.5倍劑量)。造模成功后第2天，各組大鼠均按0.1 mL/10 g灌胃給藥相應藥物(溶劑均為純凈水)，正常對照組和模型組大鼠灌胃等量純凈水，每天1次，連續14 d。

2.2 模型制備 除正常組母子同籠正常飲食外，其余各組根據文獻[6]改良制備IBS內臟痛大鼠模型。從出生第2天起母嬰分離3 h/d(8:00～11:00)，期間不予哺乳；第8～21天增加0.5%乙酸直腸內刺激，每天1次，每隔2 d增加0.1 mL，直至0.5 mL為止，正常組等量生理鹽水灌腸。至第22天起，正常飼養至第41天；第42、46天腹腔注射30 mg/mL OVA 1 mL，正常組注射等量PBS；第47～57天正常喂養，至此完成造模；第58天通過腹壁撤退反射(abdominal withdrawal reaction，AWR)評價腸道敏感度，以模型組AWR評分高于正常組(P<0.05)為造模成功。

2.3 腹壁撤退反射(AWR)檢測 檢測時分別給予各組大鼠80、60、40、20 mmHg壓力，評價結腸擴張導致的大鼠反應情況。1次擴張時間為20 s，重復6次，每次間隔4 min，取6次平均值。給予刺激時評分標準參照文獻[7]，即0分，大鼠情緒穩定；1分，偶有扭動頭部；2分，腹背部肌肉輕微收縮；3分，腹背肌肉收縮的基礎上出現腹部抬離地面；4分，腹部高離地面致使腹部呈弓狀。

2.4 取材 AWR檢測完成后采用腹腔注射戊巴比妥鈉(0.4%，10 mL/kg)麻醉各組大鼠，迅速切開腹腔，暴露脊髓段取腰骶段(L6～S2)，置于4%甲醛溶液中4 ℃固定12 h。

2.5 免疫組化染色檢測ox42表達 脊髓組織的石蠟切片經脫蠟、水化后用3%雙氧水孵育10 min，PBS沖洗2 min×3次。滴加一抗兔抗鼠多克隆抗體ox42(1∶200)37 ℃孵育2 h，PBS沖洗2 min×3次。滴加二抗山羊抗兔IgG抗體-HR多聚體PV-6001和山羊抗小鼠IgG抗體-HR多聚體PV-6002，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗2 min×3次。DAB顯色,蘇木素復染。常規脫水、透明、封片，各組取10張切片，應用軟件采集分析圖像。每張切片隨機選取5個400倍視野，觀察陽性細胞數。

2.6 Western blot檢測P2X4、BDNF蛋白表達 將脊髓腰骶段剪成碎片裂解勻漿，離心(4 ℃、12 000 r/min，10 min)后提取上清液，用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，蛋白經變性、上樣、電泳、轉膜后，將PVDF膜加入適量封閉液，放入相應的一抗溶液，37 ℃恒溫水浴搖床上封閉2 h，搖床上洗膜3次，將洗好的PVDF膜放于配制好的二抗溶液，搖床上孵育2 h再洗膜；采用ECL顯色，并根據不同顯影光強度調整曝光條件用圖片分析軟件進行掃描分析，以目的蛋白與β-actin密度比值作為待測目的蛋白相對表達量。

3 結果

3.1 大鼠一般狀況 正常組大鼠進食正常，毛發光澤，行動靈活；造模大鼠毛發失去光澤，行動遲緩，喜好扎堆，收腹、舔舐腹部等現象；灌服大建中湯和匹維溴銨后，大鼠進食和毛發恢復正常，舔舐腹部現象消失。

3.2 大建中湯對IBS內臟痛大鼠模型腹痛的影響 與正常組比較，模型組AWR評分在60、40、20 mmHg壓力下增加，腸道痛覺上升(P<0.05，P<0.01)，證明成功造模；與模型組比較，AWR評分在40、20 mmHg壓力下，匹維溴銨組，大建中湯高、中劑量組減少(P<0.05，P<0.01)，降低模型大鼠腸道痛覺；與匹維溴銨組比較，在40 mmHg壓力下的AWR評分，大建中湯高劑量組治療效果要優于匹維溴銨組(P<0.05)。見表1。

表1 大建中湯對各組大鼠AWR評分的影響(分，

3.3 大建中湯對IBS內臟痛模型大鼠脊髓腰骶段ox42陽性表達的影響 ox42陽性出現棕黃色顆粒，主要定位在細胞胞質中，少量定位在細胞核中。與正常組比較，模型組ox42個數增加(P<0.01)；與模型組比較，匹維溴銨組，大建中湯高、中劑量組ox42個數降低(P<0.01)，大建中湯低劑量組ox42個數降低(P<0.05)。見表2、圖1。

表2 大建中湯對各組大鼠ox42陽性表達的影響

圖1 大建中湯對各組大鼠ox42陽性表達的影響(IHC，×400)Fig.1 Effects of Dajianzhong Decoction on positive expression of ox42 in rats of various groups (IHC，×400)

3.4 大建中湯對IBS內臟痛模型大鼠脊髓腰骶段P2X4、BDNF的影響 與正常組比較，模型組P2X4、BDNF蛋白水平增加(P<0.01)；與模型組比較，匹維溴銨組，大建中湯高、中劑量組P2X4、BDNF蛋白水平降低(P<0.01)，大建中湯低劑量組P2X4、BDNF蛋白水平降低(P<0.05)。見表3、圖2。

表3 大建中湯對IBS內臟痛模型大鼠P2X4、BDNF蛋白的影響

注：A為正常組，B為模型組，C為大建中湯低劑量組，D為大建中湯中劑量組，E為大建中湯高劑量組，F為匹維溴銨組。圖2 大建中湯對IBS內臟痛模型大鼠P2X4、BDNF蛋白的影響Fig.2 Effects of Dajianzhong Decoction on P2X4 and BDNF proteins in IBS rat models with visceral pain

4 討論

隨著人們對IBS內臟痛的認識逐漸加深，有學者提出了神經-免疫-內分泌網絡失調機制[8]，但因發病機制仍未明確，臨床尚未有特效藥。中醫學將IBS歸納為“腹痛”“泄瀉”等范疇，雖病位在腸，但其本在脾，故證候類型多歸納為脾虛證或脾陽虛證[9]。中醫學認為其病位在脾胃，病因有氣滯、感寒、血凝、蟲積等，病機為脾胃虛寒，運化乏力，氣血不足“不榮則痛”及氣機阻滯，氣血經脈運行不暢“不通則痛”。《金匾要略》記載的大建中湯是治療腹痛的經典方劑，針對腹痛病位在脾胃，脾胃虛寒之證。臨床研究也表明大建中湯能夠治療多種急慢性內臟痛，療效確切[10]。

因IBS病因復雜，所以本實驗通過母嬰分離方法造成新生期大鼠早期負性生活事件導致其成年后內臟痛覺敏化；采用乙酸刺激損傷結直腸黏膜造成大鼠內臟高敏感性；再利用卵清白蛋白腹腔注射方式使其侵入損傷的腸道致敏等，建立更符合IBS實際情況的綜合性動物模型。本實驗結果表明，造模大鼠出現行動遲緩、收腹、舔舐腹部、肛周污濁等IBS內臟痛癥狀。同時，IBS模型大鼠內臟敏感性增加(P<0.05,P<0.01)，符合IBS臨床特點。因而本實驗模型具有較理想的臨床實用意義。

AWR評分是IBS內臟痛的主要檢測手段。本次研究結果表明，IBS內臟痛大鼠AWR評分在3個擴張壓力均有升高，表明模型大鼠腸道在長期的傷害性刺激下形成IBS慢性內臟痛，由于中樞以及外周的雙重疼痛敏化，大鼠痛閾降低，痛行為表現明顯。與模型組比較，經大建中湯治療后，大鼠AWR評分在3個擴張壓力下均降低，趨于正常。表明大建中湯能夠使IBS內臟痛大鼠痛閾升高，疼痛行為改善，提示大建中湯對內臟痛大鼠有明顯的鎮痛作用。實驗中40 mmHg壓力下AWR評分，大建中湯組優于匹維溴銨組，這可能與大建中湯的多靶點鎮痛作用有關。前期研究中[11]，課題組發現大建中湯可通過抑制神經遞質五羥色胺(5-HT)產生和釋放，下調神經遞質5-HTP(5-羥基色氨酸)、5-HIAA(5-羥基吲哚酸)水平,從而達到鎮痛作用，而匹維溴銨針對上述疼痛靶點的作用尚未相關報道。

腹腔內結直腸等器官均通過副交感盆神經投射至脊髓腰骶段[12]，有學者研究發現，脊髓腰骶段傳入神經纖維數目在IBS慢性內臟痛大鼠模型中明顯增多，這提示脊髓腰骶段可能參加了IBS慢性內臟痛的中樞敏化過程[13]。因此，本實驗選取IBS慢性內臟痛模型大鼠脊髓腰骶段(L6～S2)作為研究對象。

ox42是小膠質細胞的特異性免疫標記物，僅表達于該細胞表面上，既可以作為其活化的指標，又可以標記小膠質細胞[14-15]。本研究發現，模型組大鼠脊髓腰骶段ox42陽性表達較正常組增加(P<0.01)，大建中湯高、中、低劑量組ox42陽性表達平與模型組比較降低(P<0.01)，表明IBS內臟痛大鼠脊髓腰骶段小膠質細胞活化，大建中湯能夠抑制模型組大鼠脊髓腰骶段小膠質細胞活化。研究發現在神經病理性疼痛中，小膠質細胞和P2X4受體在脊髓背角活化明顯，這一過程很可能參與了痛敏異常的發生[16]。雖然神經病理性痛與慢性內臟痛發病機制有所不同，但這卻為本實驗研究IBS內臟痛提供了新的思路。本次實驗研究發現模型組大鼠脊髓腰骶段P2X4受體比正常組表達升高(P<0.01)，且大建中湯能夠降低模型組P2X4受體表達。有研究發現，P2X4受體僅在小膠質細胞上表達[17]。由此推測，很可能P2X4受體介導了小膠質細胞參與IBS內臟異常痛覺的產生，其過度表達導致了IBS慢性內臟痛敏的發生。

有研究發現在P2X4受體被激活后，會誘發p38MAPK蛋白激酶(p38絲裂原活化蛋白激酶)活化，從而引發細胞釋放大量的各種細胞因子，激活神經元引起中樞痛覺高敏狀態[18]。本次實驗結果與上述研究一致，本研究發現在IBS內臟痛大鼠腰骶段BDNF蛋白表達比正常組有升高(P<0.01)，且大建中湯能夠抑制模型組BDNF表達。由此推測，在IBS內臟痛時小膠質細胞活化后釋放的BDNF很可能是上述生物活性因子之一。這與Long等[19]發現的外周損傷可能是通過活化小膠質細胞上P2X4受體，使BDNF合成增加進而誘發痛敏異常的研究結果一致。

本研究提示，在IBS內臟痛大鼠脊髓腰骶段小膠質細胞及其表面上P2X4受體均顯著活化，使BDNF合成和釋放增多，從而BDNF可能作用于神經元，最終導致了IBS內臟痛中樞痛覺高敏狀態。大建中湯可能通過抑制P2X4受體介導小膠質細胞活化，進而阻止小膠質細胞合成和釋放BDNF，降低內臟痛覺高敏狀態。但是BDNF在IBS內臟痛中如何作用于神經元，其內臟中樞敏化機制還有待進一步研究。