HPLC法同時測定趕黃草中4種成分

史鵬杰， 程嘉希， 黃豆豆， 董志穎， 孫連娜

(上海中醫藥大學中藥學院，上海 201203)

趕黃草為虎耳草科扯根菜屬植物扯根菜PenthorumchinensePursh的干燥地上部位，別名扯根菜、水楊柳、水澤蘭，具有利水除濕、祛瘀止痛的作用，常用于治療黃疸、經閉、水腫跌打損傷等癥[1]，以其為原料的單方制劑在臨床中多用于治療慢性乙肝、急性病毒性肝炎等癥[2-4]，在治療、保護肝損傷等方面也有較多研究報道[5-11]。根據文獻調研結果，趕黃草中主要化學成分為黃酮、木脂素及酚酸，一些萜類、酯類、揮發油類等成分也均有報道[12]。目前，2020年版《中國藥典》中尚未收載趕黃草的質量標準，地方質量標準僅要求槲皮素含量不少于0.1%，但該成分在趕黃草中含量低，不具備專屬性，無法作為質量標志物來評價藥材品質。喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷具有較好的抗肝損傷活性[13]，同時連有多個沒食子酰基且成環的多酚類成分，pinocembrin-7-O-[4″,6″-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose、pinocembrin-7-O-[3″-O-galloyl-4″,6″-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose、thonningianin A亦具有較好的抗肝纖維化活性[7]。此外，亦有報道上述大環多酚具有一定的降糖活性[8]，具有成為趕黃草質量標志物的潛力。在此基礎上，本研究建立了HPLC法同時測定趕黃草中上述4種活性成分的含量，以期更加全面科學地對其質量進行評價。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；XS105DU 電子天平、XS104 電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；Centrifuge 5810R高速臺式冷凍離心機(德國Eppendorf 公司)；Milli-Q超純水凈化儀(美國Millipore公司)；N-1300旋轉蒸發儀(東京理化器械株式會社)；SY-360H超聲儀、HWS-24恒溫水浴鍋(上海誠獻儀器設備有限公司)。

1.2 藥物與試劑 喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷對照品(自制，純度≥98%，批號20181117)、pinocembrin-7-O-[4″,6″-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose對照品(自制，純度≥98%，批號20181117)、TH A對照品(自制，純度≥98%，批號20181103)、pinocembrin-7-O-[3″-O-galloyl-4″,6″-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose對照品(自制，純度≥98%，批號20181103)。甲酸(色譜純，德國Merck公司)；水(超純水，Milli-Q超純水凈化儀制備)；乙醇、甲醇(分析純，上海泰坦科技有限公司)；乙腈(色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司)。趕黃草信息見表1，經上海中醫藥大學孫連娜副教授鑒定為虎耳草科扯根菜屬植物扯根菜PenthorumchinensePursh的干燥地上部分，保存于上海中醫藥大學中藥資源與生物技術研究中心。

表1 樣品信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm × 250 mm, 5 μm)；流動相0.5%甲酸水(A)- 乙腈(B)，梯度洗脫(0～10 min，28%～30%B; 10～20 min，30%～36%B; 20～22 min, 36%～39%B; 22～30 min, 39%～40%B; 30～35 min, 40%～90%B; 35～37 min, 90%～28%B; 37～40 min, 28%B)；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長280 nm；進樣量10 μL。

2.2 對照品貯備液制備 取各對照品粉末適量，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加80%甲醇制備成喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷、pinocembrin-7-O-[4″,6″-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose、pinocembrin-7-O-[3″-O-galloyl-4″,6″-(S)-hexahydro-xydiphenoyl]-β-D-glucose、thonningianin A質量濃度分別為0.302 0、 0.600 8、 0.598 4、 0.499 2 mg/mL的溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備 取藥材適量，粉碎，過3號篩，取約1.0 g，精密稱定，置于250 mL圓底燒瓶中，精密加入80%甲醇100 mL，密塞，稱定質量，回流提取1 h，放涼，用80%甲醇補足減失質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 專屬性考察 在“2.1”項色譜條件下，上述溶液及空白溶液的色譜圖見圖1。由此可知，供試品溶液中4種成分色譜峰保留時間與對照品溶液一致，空白溶液于相同保留時間處無干擾，表明該方法專屬性良好。

1.喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷 2.pinocembrin-7-O-[4″,6″-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose 3.pinocembrin-7-O-[3″-O-galloyl-4″,6″-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose 4.thonningianin A1.pinocembrin-7-O-β-D-glu coside 2.pinocembrin-7-O-[4″,6″-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose 3.pinocembrin-7-O-[3″-O-galloyl-4″,6″-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose 4.thonningianin A圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.5 線性關系考察 精密移取對照品貯備液適量，逐級稀釋，依次制得6個質量濃度，在“2.1”項色譜條件下進樣。以待測成分質量濃度為橫坐標 (X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，結果見表2，表明各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系

2.6 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣6次，測得喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷、pinocembrin-7-O-[4″,6″-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose、pinocemb-rin-7-O-[3″-O-galloyl-4″,6″-(S)-hexahydroxydi-phenoyl]-β-D-glucose、thonningianin A峰面積RSD分別為0.17%、1.15%、0.18%、0.12%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗 取藥材(S13)，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，于0、4、8、12、24 h在“2.1”項色譜條件下進樣，測得喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷、pinocembrin-7-O-[4″,6″-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose、pinocembrin-7-O-[3″-O-galloyl-4″,6″-(S)-hexahydroxydiphen-oyl]-β-D-glucose、thonningianin A峰面積RSD分別為1.21%、2.04%、0.81%、0.68%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.8 重復性試驗 取藥材(S13)，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，平行6份，在“2.1”項色譜條件下進樣，測得喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷、pinocembrin-7-O-[4″,6″-(S)-hexahydroxydi-phenoyl]-β-D-glucose、pinocembrin-7-O-[3″-O-galloyl-4″,6″-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose、thonningianin A峰面積RSD分別為1.32%、1.02%、0.90%、0.48%，表明該方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗 取藥材(S13)1.0 g，精密稱定，按100%水平加入對照品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，平行6份，在“2.1”項色譜條件下進樣，計算回收率。結果，喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷、pinocembrin-7-O-[4″,6″-(S)-hexahydroxy-diphenoyl]-β-D-glucose、pinocembrin-7-O-[3″-O-galloyl-4″,6″-(S)-hexahydroxydi-phenoyl]-β-D-glucose、thonningianin A平均加樣回收率分別為101.30%、102.04%、100.90%、101.55%，RSD分別為2.54%、0.88%、0.82%、1.43%。

2.10 樣品含量測定 取13批藥材適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，計算含量，結果見表3。

表3 各成分含量測定結果(mg/g，n=3)

3 討論

取“2.2”項下對照品溶液，稍作稀釋，在“2.1”項色譜條件下進行全波長(200～400 nm)掃描，結果顯示280 nm處各待測成分均有較好吸收，而且基線平穩，故以其作為檢測波長。對不同公司提供的Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)、Waters Atlantis? T3(4.6 mm×250 mm, 5 μm)、Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，在不同流動相組合(甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.2%甲酸水、乙腈-0.5%甲酸水)下的洗脫效果進行比較，最終選擇分離效果好、重復性佳的Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱、乙腈-0.5%甲酸。對3種常見的提取方法(超聲、回流、冷浸)進行考察，比較各待測成分峰面積，發現回流法提取效果最佳，提取完全，故確定其為供試品溶液提取方法。采用不同體積分數甲醇為提取溶劑，比較各待測成分峰面積，發現80%甲醇提取最為完全，故選擇其為供試品溶液提取溶劑。比較不同回流提取次數下各成分峰面積，綜合提取效果、考慮耗時、溶劑消耗，選擇提取次數為1次，隨后考察不同提取時間下各成分峰面積，最終選擇60 min。

4 結論

本實驗建立了HPLC法測定趕黃草中4種成分的含量，發現在不同產地、批次藥材中均存在一定差異，其中喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷含量相對穩定，其他3種波動較大，該結果可為趕黃草的質量評價提供參考。