5種炮制方法對(duì)補(bǔ)骨脂脂溶性和揮發(fā)性成分的影響

李紅偉， 曹彥剛， 田連起， 石延榜， 張振凌， 李 凱*， 馮衛(wèi)生,3*

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046；2.河南省中藥特色炮制技術(shù)工程研究中心，河南 鄭州 450046；3.呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450046)

補(bǔ)骨脂為豆科植物補(bǔ)骨脂PsoraleacorylifoliaLinn.的干燥成熟果實(shí)，性溫，味辛、苦，歸腎、脾經(jīng)，具有溫腎助陽(yáng)、納氣平喘、溫脾止瀉作用,最早見(jiàn)于《藥性論》，首次明確了其藥性和功能主治，奠定了其作為溫腎助陽(yáng)中藥的地位[1]。通過(guò)歷代中醫(yī)藥學(xué)家在臨床不斷總結(jié)和實(shí)踐，對(duì)其毒性的認(rèn)識(shí)也逐漸深入，如《雷公炮炙論》“性本大燥，毒”，首次創(chuàng)立解毒炮制工藝，《本草綱目》提出炮制解毒理論，《本草害利》進(jìn)一步明確其毒性的致病機(jī)理以及禁忌癥，《本草便讀》認(rèn)為其毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)為“辛熱香燥”等。

現(xiàn)代研究表明，補(bǔ)骨脂具有多種生物活性，但同時(shí)也具有肝、腎和細(xì)胞等毒性，且部分毒性成分又是其有效成分[1]。作為種子類和香料類藥物，補(bǔ)骨脂具有豐富的脂溶性和揮發(fā)性成分，且臨床應(yīng)用常見(jiàn)打粉入丸散吞服。因此，研究其所含脂溶性和揮發(fā)性成分，以及炮制對(duì)這類成分的影響是十分必要的。本研究采用GC-MS法和頂空進(jìn)樣技術(shù)，分析補(bǔ)骨脂臨床常用5種炮制方法對(duì)其脂溶性和揮發(fā)性成分組成和含量的影響，探討其炮制-成分-藥效-毒性之間的關(guān)聯(lián)性，為臨床合理用藥提供參考。

1 材料

GC-2010Uira型氣相色譜-質(zhì)譜儀、TELEDYNE TEKMAR HT3頂空自動(dòng)進(jìn)樣器(日本島津公司)；N1100VWD型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海愛(ài)朗儀器有限公司)。補(bǔ)骨脂(批號(hào)180301)購(gòu)自亳州市張仲景中藥飲片有限責(zé)任公司，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)董誠(chéng)明教授鑒定為豆科植物補(bǔ)骨脂PsoraleacorylifoliaL.的干燥成熟果實(shí)。石油醚(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)202003101，500 mL，沸程30～60 ℃)；甲醇(一級(jí)色譜純，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司，批號(hào)20200507，500 mL，純度≥99.9%)；無(wú)水硫酸鈉(分析純，批號(hào)20151202，500 g，純度≥99.0%，北京化工廠)；正己烷(色譜純，批號(hào)2020042003，500 mL，純度≥97.0%，山東禹王和天下新材料有限公司)。三氟化硼甲醇絡(luò)合物(上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)C10006531，100 mL)。精純加碘鹽(中鹽長(zhǎng)江鹽化有限責(zé)任公司，批號(hào)C201912280211)；羊脂油來(lái)自綿羊；黃酒(紹興柯橋第三酒廠，批號(hào)20191225A)。

2 方法

2.1 炮制品制備

2.1.1 清炒品 取凈補(bǔ)骨脂，倒入炒制容器中，文火炒至膨脹、迸裂，放涼，即得。

2.1.2 雷公品 取凈補(bǔ)骨脂，加黃酒拌勻，悶透后傾出，加入3倍量水浸72 h，濾過(guò)，置蒸鍋內(nèi)蒸6 h，取出，于50 ℃烘箱內(nèi)干燥，放涼，即得。每100 kg凈補(bǔ)骨脂用黃酒、水各300 kg[2]。

2.1.3 油炙品 先將羊脂油融化去渣，再加入凈補(bǔ)骨脂，拌炒至微黃為度，即得。每100 kg凈補(bǔ)骨脂用羊脂油10 kg。

2.1.4 鹽炙品 取凈補(bǔ)骨脂，鹽炙法炒至鼓起，即得。每100 kg凈補(bǔ)骨脂用食鹽2 kg，水量為鹽的4～5倍[3]。

2.1.5 鹽蒸品 將補(bǔ)骨脂洗凈，加鹽水和勻，蒸1 h，即得。每100 kg凈補(bǔ)骨脂用食鹽2 kg，水量為鹽量的5倍[3]。

2.2 脂溶性成分提取和衍生化處理 取生品和“2.1”項(xiàng)下各炮制品適量，加入20倍量石油醚，索氏回流提取法(60 ℃)提取8 h，得到脂溶性成分，計(jì)算得率，公式為y=a/b×100%，其中y為脂溶性成分得率，a為補(bǔ)骨脂及其炮制品分別所提取的脂溶性成分質(zhì)量，b為補(bǔ)骨脂及其炮制品質(zhì)量，炮制品折合為原藥材質(zhì)量。

取樣品0.15 g，加入0.5 mol/L KOH甲醇溶液4 mL，65 ℃水浴皂化30 min，冷卻降溫后加入10%三氟化硼(BF3)甲醇溶液5 mL[8.5 mL(60%BF3)-50 mL]，65 ℃水浴2 min，冷卻后分別加入正己烷、飽和NaCl水溶液各2 mL，取上清液，加無(wú)水Na2SO4干燥，濾過(guò)，進(jìn)樣。

2.3 揮發(fā)性成分提取 取補(bǔ)骨脂粉末(過(guò)40目篩)4.0 g，精密稱定，置20 mL頂空瓶中密封。頂空進(jìn)樣條件為樣品瓶加熱溫度120 ℃；傳輸線溫度160 ℃；平衡時(shí)間15 min；平衡溫度140 ℃；進(jìn)樣時(shí)間1 min。

2.4 GC-MS分析

2.4.1 GC條件

2.4.1.1 脂溶性成分 HP-FFAP型石英毛細(xì)管柱(30 m×0. 32 mm，0.25 μm)；載氣高純氦氣(99.999%)；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度240 ℃；分流比100∶1；進(jìn)樣量1.0 μL；程序升溫(80 ℃保持2 min，10 ℃/min升至190 ℃，保持2 min，2 ℃/min升至230 ℃，保持15 min)。

2.4.1.2 揮發(fā)性成分 Rxi-5MS型石英毛細(xì)管柱(30 m×0. 25 mm，0.25 μm)；載氣高純氦氣(99.999%)；體積流量1.0 mL/min；程序升溫(初始溫度40 ℃，保持 3 min，10 ℃/min升至240 ℃，保持1 min，10 ℃/min升至280 ℃，保持5 min)；進(jìn)樣口溫度250 ℃；分流比10∶1。

2.4.2 MS條件

2.4.2.1 脂溶性成分 碰撞氣氦氣；離子源電子轟擊源(EI源)；電子能量70 eV；掃描范圍m/z30～600；檢測(cè)器電壓0.94 kV；離子源溫度230 ℃；溶劑延遲5 min；接口溫度240 ℃。

2.4.2.2 揮發(fā)性成分 碰撞氣氦氣；離子源電子轟擊源(EI源)；電子能量70 eV；掃描范圍m/z45～600；檢測(cè)器電壓0.88 kV；離子源溫度250 ℃；溶劑延遲3.5 min；接口溫度250 ℃。

2.4.3 MS檢索和定量測(cè)定 質(zhì)譜圖用美國(guó)國(guó)家科學(xué)技術(shù)研究所的NIST 質(zhì)譜庫(kù) NIST14、NIST17系統(tǒng)譜庫(kù)自動(dòng)檢索，結(jié)合文獻(xiàn)，分別與八峰索引和EPA/NIH對(duì)照，發(fā)現(xiàn)匹配度均在70%以上。按峰面積歸一化法計(jì)算各成分相對(duì)含量，結(jié)果見(jiàn)表1～2。

表1 各炮制品中脂溶性成分組成和相對(duì)含量(%)

續(xù)表1

續(xù)表1

表2 各炮制品中揮發(fā)性成分組成和相對(duì)含量(%)

續(xù)表2

續(xù)表2

3 結(jié)果

3. 1 GC-MS分析 脂溶性成分總離子流圖見(jiàn)圖1，揮發(fā)性成分總離子流見(jiàn)圖2。

圖1 生品脂溶性成分總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatogram of liposoluble constituents in raw product

圖2 生品揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.2 Total ion current chromatogram of volatile constituents in raw product

3.2 組成及含量分析

3.2.1 脂溶性成分 補(bǔ)骨脂5種炮制品得率為油炙品>鹽蒸品>鹽炙品>雷公品>清炒品，脂溶性成分提取率為油炙品>生品>鹽炙品>雷公品>鹽蒸品>清炒品，檢出成分種類為油炙品>鹽蒸品>清炒品>鹽炙品>雷公品，鑒定成分種類為油炙品>鹽蒸品>清炒品=鹽炙品>雷公品，種類主要以脂肪酸和萜類(單萜和倍半萜)為主，占到檢出成分種類的90.00%以上。相對(duì)于生品，所含不飽和脂肪酸的種類為油炙品>鹽炙品=鹽蒸品=雷公品>清炒品>生品，而相對(duì)含量為雷公品>生品>鹽炙品>清炒品>鹽蒸品>油炙品；所含飽和脂肪酸的種類為油炙品>雷公品>鹽炙品=鹽蒸品>清炒品=生品，相對(duì)含量為油炙品>鹽炙品>生品>雷公品>清炒品>鹽蒸品；所含萜類成分的種類為清炒品>鹽蒸品>鹽炙品>生品>雷公品>油炙品，相對(duì)含量為鹽蒸品>清炒品>鹽炙品>雷公品>生品>油炙品，見(jiàn)表1、3。

表3 各樣品中脂溶性成分分析結(jié)果

3.2.2 揮發(fā)性成分 5種炮制方法對(duì)補(bǔ)骨脂中揮發(fā)性成分的種類和相對(duì)含量影響存在差異，其中檢出和鑒定成分的種類均為清炒品>油炙品>鹽炙品>鹽蒸品>生品>雷公品，見(jiàn)表4；5種炮制方法均降低了脂肪族類揮發(fā)性成分的種類和相對(duì)含量，以及單萜類揮發(fā)性成分的相對(duì)含量，但清炒、鹽炙和鹽蒸增加了單萜類揮發(fā)性成分的種類；5種炮制方法均升高了補(bǔ)骨脂中倍半萜類揮發(fā)性成分的種類和相對(duì)含量，增加了芳香族類和其他類揮發(fā)性成分的相對(duì)含量，清炒、鹽炙和鹽蒸增加其他類揮發(fā)性成分的種類，見(jiàn)表2、4。

表4 各樣品中揮發(fā)性成分分析結(jié)果(n=3)

4 討論

4.1 炮制-“脂溶性和揮發(fā)性成分”-藥效相關(guān)性分析 補(bǔ)骨脂脂溶性和揮發(fā)性成分中部分烷酸、碳烯酸和萜類等為昆蟲(chóng)性信息素類成分，多認(rèn)為僅能夠使昆蟲(chóng)產(chǎn)生性興奮，而現(xiàn)有研究表明，β-石竹烯能明顯提高女性唾液中睪酮的濃度，提升女性的性欲，治療性欲減退[4-5]；(9Z,12Z,15Z)-十八碳三烯酸能夠通過(guò)改善四肢微循環(huán)，治療絕經(jīng)前、圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后女性所患血管舒縮癥而致的惡寒癥狀[6]。另外，匙葉桉油烯醇具有抗細(xì)菌活性，對(duì)胸膜炎有明顯的治療作用[7]；(9Z,12Z,15Z)-十八碳三烯酸能抑制炎癥和氧化應(yīng)激，治療支氣管哮喘等氣道炎癥性疾病，低濃度給藥時(shí)可以改善結(jié)腸炎的炎癥損傷[8]；β-石竹烯、香葉醇可用于治療哮喘[9-10]；茴香腦對(duì)慢性肺炎有治療作用[11]；β-石竹烯、檸檬烯、(9Z)-十八碳烯酸可用于治療結(jié)腸炎[12-14]；松油醇具有抗腹瀉作用[15]。由此表明，脂溶性、揮發(fā)性成分可能是補(bǔ)骨脂具有溫腎助陽(yáng)、納氣平喘、溫脾止瀉功效的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

此外，異胡薄荷醇、β-石竹烯、石竹素、香葉醇和松油醇具有鎮(zhèn)痛作用[16-18]，十二烷酸和十四烷酸能夠抑制睪酮誘導(dǎo)的大鼠前列腺增生，對(duì)遺尿尿頻有治療作用[19]，為補(bǔ)骨脂治療腰膝冷痛、遺尿尿頻提供了科學(xué)支撐。

4.2 炮制-“脂溶性和揮發(fā)性成分”-毒性相關(guān)性分析 補(bǔ)骨脂的諸多炮制方法皆圍繞其“性本大燥，去燥毒”為炮制目的，現(xiàn)有研究也表明補(bǔ)骨脂脂溶性成分及揮發(fā)性成分有多種生物毒性，其中十六烷酸可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，具有細(xì)胞毒性[20]；(9Z,12Z)-十八碳二烯酸能夠引起機(jī)體紅細(xì)胞的急性損傷，導(dǎo)致隱形失血，引起“傷陰”[21]；(9Z,12Z,15Z)-十八碳三烯酸高濃度時(shí)會(huì)加重結(jié)腸炎的炎癥損傷[14,22]。檸檬烯、β-月桂烯具有腎毒性和細(xì)胞毒性，產(chǎn)生遺傳毒性，有致癌和致畸風(fēng)險(xiǎn)[23]。通過(guò)炮制，以上成分含量或相對(duì)含量降低，為其炮制降低“燥毒”提供依據(jù)。

5 結(jié)論

補(bǔ)骨脂及其炮制品中脂溶性和揮發(fā)性成分既是其有效成分，又是其燥毒的物質(zhì)基礎(chǔ)，炮制降低脂溶性成分提取率，降低揮發(fā)性成分含量，改變成分種類和相對(duì)含量比例，以上可能是補(bǔ)骨脂炮制減毒增效機(jī)理之一。