不同提取工藝、蛋品蛋黃油的質(zhì)量評價及3種磷脂同時測定

王定龍， 雷雅婷， 張 也， 黃 丹， 謝昭明， 嚴(yán)建業(yè)*， 李順祥

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.懷化湘興醫(yī)藥開發(fā)應(yīng)用研究所，湖南 懷化 418000；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410208；4.湖南中醫(yī)藥研究院中藥所，湖南 長沙 410000)

蛋黃油為雉科動物家雞鮮卵的卵黃提取物，具有消腫解毒、斂瘡生肌的功效，臨床上用于燙火傷、濕疹、皮膚瘙癢等病[1]，主要含有脂肪、蛋白質(zhì)氨基酸、維生素、礦物質(zhì)[2]，其中脂肪類主要包括磷脂類、脂肪酸類[3]。蛋黃磷脂主要由磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和少量的溶血磷脂酰膽堿(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、鞘磷脂(SM)等組成，在醫(yī)藥原料、抗氧化、降血脂、增強(qiáng)記憶等方面得到廣泛的應(yīng)用[4]，是一種較好的生物活性物質(zhì)。

蛋黃油質(zhì)量決定于雞蛋質(zhì)量及提取工藝，目前關(guān)于其提取工藝的報道較多，如干餾法、有機(jī)溶劑法、超臨界CO2萃取法[5]等。課題組經(jīng)十余年探索實驗，設(shè)計出一種新的蛋黃油提取工藝(分離法)，收錄于2009年版《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[1]，該方法簡單實用，已實現(xiàn)批量生產(chǎn)能力，并且與乙醇提取工藝相結(jié)合時能顯著提高蛋黃油的質(zhì)和量。

目前，磷脂類成分的分析檢測方法主要有薄層色譜、薄層掃描色譜[6]、高效液相色譜(HPLC)[7]、紫外可見吸收光譜[8]，其中HPLC法應(yīng)用廣泛，操作簡便，靈敏度高，故磷脂分析大多該方法[9]。蛋黃油在2001年版《黑龍江省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[10]、2009年版《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》、2015年版《四川省中藥飲片炮制規(guī)范》[11]等中均有收錄，但均未建立相應(yīng)的含量測定指標(biāo)，故本實驗采用HPLC-ELSD法同時測定蛋黃油中磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰乙醇胺3種磷脂類成分的含量，以期為其質(zhì)量評價和控制提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200色譜儀(美國Agilent公司)；Alltech 3300蒸發(fā)光檢測器(美國Grace公司)；Option R7 utra AN超純水系統(tǒng)(英國Elga公司)；KQ5200DV數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；CP224C分析天平[奧豪斯儀器(上海)有限公司]；分離儀(自制)。

1.2 試劑與藥物 不同品種雞蛋購自于湖南、貴州、河北、江西、湖北等地。磷脂酰膽堿PC(純度≥98%，批號190064-201902)、溶血磷脂酰乙醇胺LPE(純度≥98%，批號190024-201804)對照品均購于中國食品藥品檢定研究院；磷脂酰乙醇胺PE(純度≥98%，批號1002386399)對照品購于美國Sigma公司。甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 不同提取工藝蛋黃油比較 取同一批鮮雞蛋，煮熟后手工取出蛋黃，研粉，置于烤箱中烤干，各稱900 g，分別采用干餾法、95%乙醇提取法、專用分離儀法、專用分離儀法+乙醇提取法進(jìn)行提取，從蛋黃油外觀(顏色、氣味、透明度、性狀)、收率[(蛋黃油質(zhì)量/干燥蛋黃粉質(zhì)量)×100%]兩方面進(jìn)行比較，結(jié)果見表1。由此可知，專用分離儀法+乙醇提取法提取時收率較高，達(dá)54.9%，其余3種提取方法差別不大；不同提取方法下外觀性狀有較大差異，以專用分離儀法、專用分離儀法+乙醇提取法提取者較佳。

表1 不同提取工藝下蛋黃油外觀、收率

2.2 不同蛋品蛋黃油比較

2.2.1 雞蛋 品系因素在生物進(jìn)化中具有十分重要的意義，而且雞肉、雞蛋所含的人體必需氨基酸、脂肪酸等成分隨著雞種及飼養(yǎng)方法的不同而有所差異，甚至是有或無的區(qū)別[5]。因此，不同品質(zhì)雞蛋所提取出的蛋黃油質(zhì)量差異較大。

為了鑒別土雞蛋與飼料蛋[12]，課題組進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)好的土雞蛋個小、殼厚中、殼衣厚、黃大質(zhì)緊、呈金黃色、味香，見表2。鮮蛋水煮后有一定的吸水性，雞品好的雞蛋較明顯；蛋黃與蛋白質(zhì)量比重越大，一般說明蛋品質(zhì)量越好；含水量越高，有形成分越少，雞蛋質(zhì)量越差。稱取各品種生鮮雞蛋5 kg，浸冷水中煮沸15 min后再浸入冷水中10 min，撈起濾水5 min后稱定質(zhì)量，再手工剝離蛋黃、蛋白、蛋殼稱定質(zhì)量，蛋黃、蛋白壓碎后與蛋殼分別置于100 ℃烘箱中，注意定時翻攪，以感覺完全干燥后稱定質(zhì)量，結(jié)果見表3，可知蛋黃比重依次為湖南懷化雪峰烏骨雞蛋>貴州思南土雞蛋>湖南辰溪綠殼雞蛋>河北承德養(yǎng)殖場雞蛋，含水量依次為湖南懷化雪峰烏骨雞蛋<貴州思南土雞蛋<湖南辰溪綠殼雞蛋<河北承德養(yǎng)殖場雞蛋。

表2 不同雞蛋感官比較

表3 不同雞蛋含水量比較

2.2.2 蛋黃粉 “2.2.1”項下結(jié)果顯示，不同品質(zhì)雞蛋蛋黃比重及性狀都存在差異，質(zhì)量好的雞蛋蛋黃大、呈金黃色、質(zhì)緊、富有彈性，推測不同蛋品所得蛋黃粉質(zhì)量可能也會有所區(qū)別。取不同雞蛋各1 kg，水煮熟取蛋黃各10個，考察其外觀、收率，進(jìn)行加壓實驗(玻璃塊下壓1.0 cm，以蛋黃裂開為標(biāo)準(zhǔn)，3個以內(nèi)柔性較差，3個以上柔性差，無裂開柔性好)，發(fā)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)土雞蛋制作的蛋黃粉呈金黃色，顆粒細(xì)小，柔性良好，油膩感明顯，烘烤時香味濃郁，收率高，見表4。

表4 不同蛋黃粉外觀、收率

2.2.3 蛋黃油 為了探討雞蛋質(zhì)量與蛋黃油品質(zhì)及提取產(chǎn)量之間是否存在相關(guān)性，本實驗對不同蛋品提取蛋黃油品質(zhì)、收率進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)湖南懷化雪峰烏骨雞蛋、貴州思南土雞蛋所提取的蛋黃油呈黃棕色，蛋香味濃郁；湖南辰溪綠殼雞蛋、河北承德飼料雞蛋所提取的蛋黃油呈淡黃色，蛋香味較淡。表5顯示，不同蛋品提取蛋黃油的收率有所差異，表明雞蛋質(zhì)量與蛋黃油提取產(chǎn)量有相關(guān)性，以蛋品質(zhì)量佳的湖南懷化雪峰烏骨雞蛋最高。

表5 不同蛋黃油品質(zhì)、收率

2.3 HPLC-ELSD法同時測定3種磷脂含量

2.3.1 色譜條件 Venusil XBP Silica色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相甲醇-水(90∶10)；體積流量0.8 mL/min；漂移管溫度66 ℃；霧化氣空氣，體積流量1.8 L/min；增益4；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見圖1。

1.磷脂酰乙醇胺 2.溶血磷脂酰乙醇胺 3.磷脂酰膽堿圖1 各成分HPLC-ELSD色譜圖

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱取各對照品適量，甲醇制成444、278、907 μg/mL，即得。

2.3.3 供試品溶液制備 取蛋黃油約0.075 g，精密稱定，溶于三氯甲烷-甲醇(1∶1)中，超聲(40 kHz、200 W)處理15 min，放冷，三氯甲烷-甲醇(1∶1)定容至25 mL，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3.4 方法學(xué)考察

2.3.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取各對照品適量，甲醇稀釋至不同質(zhì)量濃度，在“2.3.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定。以峰面積(Y)對對照品質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表6。

表6 各磷脂線性關(guān)系

2.3.4.2 精密度試驗 取對照品溶液適量，在“2.3.1”項色譜條件下各進(jìn)樣測定6次，測得磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿峰面積RSD分別為1.49%、2.06%、2.45%，表明儀器精密度良好。

2.3.4.3 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液(湖北黃岡土雞蛋)適量，于0、2、4、8、12、24 h在“2.3.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿峰面積RSD分別為1.78%、2.59%、1.64%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4.4 重復(fù)性試驗 精密稱取湖北黃岡土雞蛋6份，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿含量RSD分別為2.57%、1.96%、2.13%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4.5 加樣回收率試驗 取湖北黃岡土雞蛋約0.037 5 g，精密稱定，共6份，加入適量對照品溶液，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算回收率，結(jié)果見表7。

表7 各磷脂加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

2.3.4.6 樣品含量測定 精密稱取不同蛋品蛋黃油各0.075 g，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算含量，見表8。

表8 各磷脂含量測定結(jié)果(mg/g)

3 討論與結(jié)論

蛋黃油提取工藝直接影響其質(zhì)量，本實驗以專用分離儀提取后其性狀理想，收率為35%，再將分離后蛋黃渣用95%乙醇提取，總收率可達(dá)60%。目前，尚無采用專用分離儀提取蛋黃油的報道，故本實驗中的提取方法具有一定實用性、創(chuàng)新性，并與乙醇提取工藝相結(jié)合，現(xiàn)已完成中試并批量生產(chǎn)，有望應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)中。另外，雞蛋質(zhì)量與蛋黃油質(zhì)量緊密相關(guān)，本實驗發(fā)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)土雞蛋蛋黃大而質(zhì)緊，呈黃紅色或金黃色，蛋香味濃，不僅產(chǎn)量高，而且質(zhì)量好。

本實驗采用HPLC法測定蛋黃油中磷脂類成分含量，并考察了不同檢測器(UV、ELSD)、流動相體系(甲醇-水、正己烷-異丙醇-水)分離情況，發(fā)現(xiàn)采用ELSD檢測器、甲醇-水體系時該類成分分離度較好，同時考察了不同體積流量(0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min)、柱溫(25、30、35、40 ℃)，發(fā)現(xiàn)體積流量、柱溫對其影響不大。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地、品種雞蛋的蛋黃油中磷脂酰膽堿含量均最高，磷脂酰乙醇胺次之，溶血磷脂酰乙醇胺最低，而且采用相同提取方法時不同蛋品蛋黃油中三者含量有所差異；同一蛋品采用不同提取工藝時，S2(乙醇提取法)中磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿含量最高，S1(干餾法)中未發(fā)現(xiàn)磷脂類成分，表明產(chǎn)區(qū)環(huán)境生態(tài)因子、蛋品質(zhì)量、不同提取工藝對蛋黃油中磷脂類成分含量有較大影響。

綜上所述，該方法簡便準(zhǔn)確，重復(fù)性好，有望為蛋黃油質(zhì)量評價和控制提供可靠的檢測方法，同時為探討雞蛋品質(zhì)形成機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。