美洲大蠊提取物外用乳膠對大鼠燙傷模型的影響

王 爽， 趙宇明， 高 新， 王雨婷， 田園園， 韓 靜*

(1.沈陽藥科大學制藥工程學院，遼寧 沈陽 110016；2.沈陽藥科大學藥學院，遼寧 沈陽 110016)

燒燙傷是我們生活中常見且難以治療的外傷疾病，如果不能及時妥善的處理，可能會造成非常嚴重的后遺癥。目前治療燒燙傷的化學藥物較多，如抗菌化學藥物、銀鹽等，主要作用是抗菌、消炎、鎮痛，但化學藥物普遍存在有一些不良反應、燒燙傷的創面肌膚組織再生能力的促進效果比較差等不足之處[1]。美洲大蠊P.americana為蜚蠊科大蠊屬昆蟲，《神農本草經》和《本草綱目》中都有其入藥記載?，F在醫學表明，美洲大蠊乙醇提取物具有氨基酸、多肽、糖類等多種有效成分，具有抗菌、消炎、鎮痛、促進組織愈合、提高人體免疫力等功效[2-3]，臨床上主要用于治療燒傷、燙傷、瘺管、胃潰瘍、十二指腸潰瘍等疾病[4]。本課題組為了克服液體制劑滯留時間短，不穩定等缺點，研制出一種以美洲大蠊提取物為主要有效成分的外用乳膠。建立大鼠燙傷模型，將乳膠外敷于大鼠深Ⅱ度燙傷創面，證明其對燙傷愈合的促進作用并闡明其促進愈合的機制。

1 材料

1.1 動物 清潔級SD大鼠74只，雌雄各半，體質量(240±20)g，由沈陽藥科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK(遼)2015-0001，在實驗室適應性飼養7 d后進行實驗。動物使用及處理方法嚴格按照沈陽藥科大學動物實驗倫理委員會的要求進行。

1.2 試劑與儀器 血管內皮生長因子酶聯免疫檢測試劑盒、腫瘤壞死因子-α酶聯免疫檢測試劑盒、白細胞介素-1酶聯免疫檢測試劑盒(上海樊克生物科技有限公司)。美洲大蠊提取物浸膏(云南成滿生物科技有限公司)；新疆紫草(北京同仁堂亳州飲片有限責任公司)；其他所用試劑均為分析純。iMark酶標儀(上海領成生物科技有限公司)；H1850高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)；FSH-2組織勻漿機(常州榮華儀器制造有限公司)。

1.3 試劑與藥物 美洲大蠊提取物外用乳膠主要由美洲大蠊浸膏制得。具體制備方法如下：稱取卡波姆940，加入適量水，放置過夜使其充分溶脹，溶脹后加入丙三醇，攪拌均勻，形成乳膠基質。取新疆紫草，經橄欖油加熱提取后過濾，制得紫草油。將取紫草油和吐溫80混合到乳缽中，待充分混勻溶解后，加入少量蒸餾水，同一方向攪拌形成初乳。在初乳中加入蒸餾水均勻攪拌，將初乳稀釋成乳液，將乳液加入到乳膠基質中。將美洲大蠊提取物浸膏加少量水稀釋，加入到乳膠基質中，攪拌均勻，加入少量的三乙醇胺調節乳膠pH值，使其pH值達到6～7之間。制得的成品乳膠為質地均勻，淡粉色的半固體，附著性和延展性良好。對其性狀、離心實驗、微生物限度、穩定性等質量指標進行控制。

2 方法

2.1 模型建立 采用水浴烙鐵法[5-6]建立燙傷模型。實驗前24 h，先將大鼠長毛剪去，再用8%硫化鈉水溶液大鼠脫去背部毛發，用10%水合氯醛按0.3 mL/100 g的劑量腹腔注射將大鼠麻醉，在給藥5 min后，將其固定在大鼠解剖板上，使其背部向上。將50 g的天平砝碼放入沸水中加熱5 min，取出后立刻用干紗布擦去底部水滴，迅速接觸大鼠皮膚10 s，造成大鼠深Ⅱ度燙傷。每只大鼠背部兩側各燙傷1次，燙傷后在大鼠腹腔注射乳酸林格氏液5 mL抗休克。大鼠頸部使用膠帶固定以防止其舔舐藥物。

2.2 分組及給藥 根據體質量對大鼠進行分組，每組雌雄各6只，體質量保持相近，分籠飼養，將未分組的2只大鼠燙傷后立即處死，取其創面組織做病理組織學檢查。實驗動物分組及給藥情況如表1所示，每組12只大鼠分籠飼養，置于溫度20 ℃、相對濕度50%環境中，自由攝食飲水。給藥組分別在燙傷部位涂相應的藥物0.5 g/只，給藥部位用無菌紗布包扎，各個給藥組每天給藥兩次(早晚各一次)，連續給藥21 d。

表1 大鼠分組及給藥情況

2.3 指標檢測

2.3.1 創面愈合情況 觀察創面愈合情況，包括結痂、脫痂、愈合時間及恢復情況，對結痂、脫痂進行判定。采用透明膜創面測量法分別在第1、3、7、14、21天對每個創面進行描記并在實驗結束后歸類整理；用剪刀沿透明膜上每個創面以及標準面積單位的邊緣切割，然后放置在分析天平上稱取質量，計算創面愈合率[7]，公式為創面愈合率=[(初始燙傷面積-未愈合創面面積)/初始燙傷面積]×100%。

2.3.2 組織病理學觀察及VEGF水平檢測 造模后第 3、7、14、21天，每個時間點分別處死各組大鼠2只。另取創面全層皮膚組織100 mg左右，去除痂皮，用濾紙吸去血跡，稱重，放入生理鹽水中碾磨制成勻漿。采用ELISA法測VEGF水平，具體步驟按試劑盒說明書進行。治療21 d后，取剩余大鼠燙傷部位全層皮膚，按常規方法制備石蠟切片，HE染色，顯微鏡下觀察病理結果。

2.3.3 大鼠血清TNF-α，IL-1水平檢測 分別在燙傷后24、48 h每組各取3只大鼠，進行眼眶取血。將血液離心后取血清，采用ELISA 法測定血清TNF-α、IL-1水平，具體步驟按試劑盒說明書進行[8]。

3 結果

3.1 美洲大蠊乳膠對創面愈合情況的影響

3.1.1 創面外觀變化 如圖1所示，燙傷后創面立刻變成灰白色，創面平滑、水腫，可明顯區分燙傷和未燙區域，皮膚彈性降低，韌性增加。各組大鼠燙傷后精神萎靡，飲食減少。第1～2天，各組大鼠精神狀態逐漸恢復，飲食量逐漸增加。低劑量組和高劑量組大鼠水腫明顯消去，創面逐漸變硬；美洲大蠊提取物對照組大鼠仍有輕微水腫情況，創面發白；紫草油對照組和凝膠基質對照組的大鼠水腫明顯，創面發白。第3天，低劑量組和高劑量組大部分大鼠創面開始結痂；美洲大蠊提取物對照組創面顏色變深，水腫完全消退；其他三組大鼠創面仍為灰白色。第7天，低劑量組和高劑量組大鼠均痂皮邊緣有所脫落；其他各組大鼠痂皮顏色進一步加深。第14天，低劑量組和高劑量組大部分大鼠痂皮脫落，脫痂后的創面可明顯見到新生肉芽組織；美洲大蠊提取物對照組僅少部分大鼠脫痂；其余各組均未脫痂。第21天，低劑量組和高劑量組所有大鼠均已脫痂完成，創面基本痊愈；美洲大蠊提取物對照組大部分大鼠開始脫痂；紫草油對照組僅少部分大鼠開始脫痂；其余兩組大鼠均未脫痂，其中模型組大部分大鼠痂皮較厚，表面粗糙、干燥。

注：A為低劑量乳膠組，B為高劑量乳膠組，C為提取物對照組，D為紫草油對照組，E為凝膠基質對照組，F為模型組。圖1 燙傷后各組大鼠創面外觀圖

3.1.2 創面愈合率 于燙傷后1、3、7、14、21 d統計創面愈合率。結果顯示，燙傷后前5天各組燙傷組織創面愈合率無明顯差異，但隨著時間延續，各用藥組大鼠創面愈合率呈明顯上升趨勢。如表2所示，燙傷后第7天，低劑量組、高劑量組和美洲大蠊提取物對照組大鼠創面愈合率提高(P<0.05)；燙傷后第14天，由于部分大鼠創面開始脫痂，低劑量組和高劑量組愈合率提高(P<0.01)，其他各組愈合率也出現明顯變化；燙傷后21 d，低劑量組和高劑量組大鼠創面均已痊愈，其中高劑量組創面愈合率最高(P<0.01)，其他各組大鼠愈合率也明顯提高。

表2 不同時間點各組大鼠創面愈合率

3.2 美洲大蠊乳膠對病理組織形態及VEGF水平的影響

3.2.1 組織病理學觀察 在治療21 d后，將剩余大鼠處死后，取創面進行組織病理學觀察。圖2為6組大鼠病理切片對比圖，由圖可知低劑量組和高劑量組大鼠創面都已經恢復完全，上皮組織較厚，細胞角質化明顯，可清晰看到大量的毛囊和皮脂腺；美洲大蠊提取物對照組和紫草油對照組大鼠上皮得到較好的恢復，可觀察到恢復的毛囊和皮脂腺，但仍可見炎癥細胞浸潤；而凝膠基質對照組和模型組的大鼠上皮雖然有所恢復，但未見恢復的毛囊和皮脂腺，皮下大量炎癥細胞浸潤。

注：A為低劑量乳膠組，B為高劑量乳膠組，C為提取物對照組，D為紫草油對照組，E為凝膠基質對照組，F為模型組。圖2 各組大鼠創面皮膚組織病理切片圖(500 μm,×400)

3.2.2 VEGF 隨著時間的延續，各組大鼠創面VEGF水平逐漸增加。在燙傷后第3天各組燙傷創面組織VEGF無明顯差異；燙傷后第7天，高劑量組大鼠創面VEGF水平與模型組比較增加(P<0.05)；在燙傷后第14天，前3組與模型組比較，創面VEGF水平增加(P<0.05；P<0.01)；燙傷后第21天，前3組大鼠創面VEGF水平進一步提高，與模型組比較有統計學意義(P<0.01)，紫草油對照組大鼠創面VEGF水平與模型組比較亦然(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠創面組織VEGF水平的比較

3.3 對燙傷大鼠血清中TNF-α和IL-1水平的影響 燙傷后24、48 h，各組大鼠血清中TNF-α水平呈明顯下降趨勢，其中前三組與模型組比較有統計學意義(P<0.05,P<0.01)。燙傷后24 h，低劑量組和高劑量組大鼠血清中IL-1水平與模型組比較有統計學意義(P<0.05)，其他組與模型組比較無顯著性差異；燙傷后48 h，各組血清中IL-1水平下降，其中前3組與模型組比較有統計學意義(P<0.05,P<0.01)，見表4。

表4 燙傷后各組大鼠血清TNF-α、IL-1水平的比較

4 討論

由美洲大蠊提取物制得的康復新液具有通利血脈，養陰生肌的功效，臨床主要用于治療外傷、燒燙傷、胃潰瘍等疾病[4]，但液體制劑存在滯留時間短、難以儲存等缺點。本課題組為了克服康復新液在臨床使用上的缺點，將美洲大蠊提取物加入凝膠基質和紫草提取物等材料制成外用乳膠，該乳膠利用乳化劑使紫草油與水形成形成O/W型乳滴，使其均勻穩定地存在于凝膠基質中。由于乳膠具有網狀交聯結構，使得乳膠性狀穩定，可保持提取物中多肽和氨基酸水平。該乳膠質地柔潤、吸水性強且粘附性好，可粘附在傷口外使其中的有效成分能與傷口持續接觸防止創面過于干燥，同時隔離外界的病原微生物等有害物質，對傷口起到一定的保護作用。

低劑量組和高劑量組對大鼠創面作用效果顯著，兩組大鼠在各時間點創面外觀變化明顯且愈合率高，在治療結束后兩組大鼠創面均已愈合，而其他各組大鼠創面并沒有完全愈合。這說明美洲大蠊乳膠能加速傷口恢復，縮短愈合時間。病理組織觀察結果也進一步印證了創面外觀觀察的結果，低劑量組和高劑量組大鼠皮膚組織可清晰看到恢復的上皮組織、毛囊、皮脂腺等，沒有浸潤的炎癥細胞。而其他各組恢復程度不一，但各切片均可見數量不一的炎癥細胞，說明其創面并沒有得到完全恢復。

燒燙傷修復一般包含抗炎期、增生期、結疤期和重塑期等階段[9]。燒燙傷初期，機體在免疫系統作用下會發生一系列炎癥反應以清除受損組織和異物，并能抵抗細菌、病毒等外來物質。常見的炎癥因子有腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-1(IL-1)等。當機體嚴重燒燙傷時，會造成炎癥因子釋放過量，從而引起機體反應過度，影響創面恢復甚至造成全身性炎癥反應[10]。在本實驗研究中，兩個乳膠治療組(低劑量組和高劑量組)的TNF-α和IL-1水平于模型組比較有差異，表明該乳膠能減輕炎癥反應，改善局部微循環。細胞因子是損傷組織修復過程中重要的促進劑，參與組織修復的全過程，其水平將直接影響創面的愈合進程和修復質量。血管內皮生長因子(VEGF)是常見的細胞因子，具有促進血管通透性增加、細胞外基質變性、血管內皮細胞遷移、增殖和血管形成等作用[11-12]。在本實驗中，給藥7 d后給藥組的創面VEGF水平與模型組相比有差異，且在給藥14 d和21 d后差異最為顯著，說明美洲大蠊提取物制備的乳膠能有效增加創面組織VEGF 的釋放，能加速創面愈合。

綜上所述，美洲大蠊提取物乳膠對大鼠深Ⅱ度燙傷具有良好的保護作用，能加速大鼠深Ⅱ度燙傷創面愈合，其原理可能與促進創面組織VEGF的釋放，降低大鼠體內TNF-α、IL-1水平等有關。本研究為美洲大蠊外用乳膠的進一步應用奠定了理論基礎，并為美洲大蠊提取物外用制劑的開發提供了新的思路。