黑種草保健茶水浸液對OVA誘導小鼠過敏性哮喘的作用

廖成松， 韓陽陽， 陳志婧

(1.錫林郭勒生物工程研究院，內蒙古 錫林浩特 026000；2.錫林郭勒職業學院，內蒙古 錫林浩特 026000)

過敏性哮喘是由包括肥大細胞、嗜酸性粒細胞和T細胞等多種細胞參與的慢性氣道炎癥類疾病，已成為全球性公共衛生領域的重大問題[1]。據不完全統計，目前全世界各個年齡段患哮喘疾病的人數高達3.39億[1]。過敏性哮喘以支氣管粘膜增厚、水腫、黏液分泌過多、嗜酸性細胞浸潤等為主要特征，其發病機制與T細胞、炎癥細胞因子、IgE、Th1/Th2 細胞功能失衡等密切相關[2-4]。家黑種草、甘草、小茴香、茶葉均具有抗炎、抗氧化、抗過敏等作用，是國內外傳統方劑中的重要成分[5-10]。Schleicher等[11]報道，將家黑種草、甘草、小茴香和茶葉按照一定比例混合制作成黑種草保健茶有顯著的提高免疫力，緩解過敏性疾病癥狀的作用。本研究通過構建OVA誘導的過敏性小鼠哮喘模型，觀察了該黑種草保健茶對哮喘模型小鼠肺部炎癥和肺組織病理變化的影響，并對其作用機制進行了初步探討。

1 材料

1.1 試劑與藥物 家黑種草子為黑種草屬植物家黑種草Nigellasativa的干燥種子，產地新疆伊犁，批號YL20200202；甘草為甘草屬植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch的干燥根，產地新疆伊犁，批號200101；小茴香為傘形科植物茴香FoeniculumvulgareMill.的干燥成熟果實，產地甘肅武威，批號191001，以上藥材均購于安徽嘉佑中藥飲片有限公司，經內蒙古錫林郭勒盟蒙醫醫院貢斯琴主任醫師鑒定為正品。紅茶購于內蒙古錫林浩特市德克隆超市。

卵蛋白(OVA)(Ⅴ級，美國Sigma公司，貨號A5503，批號BC88709X)；氫氧化鋁凝膠(美國Thermo Fisher Scientific公司，貨號77161，批號UE284411B)；地塞米松磷酸鈉注射液(國藥集團容生制藥有限公司，批號13011911)；迪夫快速染色液(北京索萊寶科技有限公司，貨號G1540，批號20190808)；蘇木精(貨號H9627，批號SLBN3 249 V)、伊紅(貨號E6003，批號62R80915X)(美國Sigma公司)；PAS染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號G1281)；姬姆薩(Giemsa)染色試劑盒(上海源葉生物科技公司，貨號R20649)；IL-4 ELISA試劑盒(貨號88-7044)、IL-5 ELISA試劑盒(貨號88-70540)、IL-13 ELISA試劑盒(貨號88-7137)、IL-10 ELISA試劑盒(貨號BMS614INST)、IL-12 ELISA試劑盒(貨號BMS616)、IFN-γ ELISA試劑盒(貨號BMS606INST)、IgE ELISA試劑盒(貨號88-50460)、IgG1 ELISA試劑盒(貨號88-50410)(美國Invitrogen公司)；BCA蛋白試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，貨號P0012)。其余試劑均為國產分析純。

1.2 動物 BALB/c小鼠72只，雄性，5周齡，SPF級，購自上海吉輝實驗動物飼養有限公司，動物生產許可證號SCXK(滬)2017-0012。

1.3 儀器 FZ102微型植物粉碎機(臨沂正衡化玻儀器有限公司)；SC-AC-1200AS型電子天平(蘇州新區蘇測電子科技有限公司)；RM2235型輪轉式切片機(德國Leica公司)；TEC 2500型病理組織漂烘儀(常州市郝思琳醫用儀器有限公司)；BX43型顯微鏡(日本Olympus公司)；PYX-DHS500BS-Ⅱ型隔水式恒溫培養箱(上海躍進醫療器械有限公司)；SPectraMax Plus 384型全波長酶標儀(美國MD公司)；80-2型臺式低速離心機(上海醫療器械有限公司)。

2 方法

2.1 黑種草保健茶水浸液制備 將家黑種草子、甘草、小茴香、紅茶用粉碎機粉碎成粉末，稱取家黑種草子粉末80 g，倒入容器中，加入200 mL熱水充分溶解，再加入甘草、小茴香、紅茶粉末各26.6 g，再加入200 mL熱水，混合均勻，加蓋浸泡10 min，3 000 r/min 離心10 min，取上清液，即得，藥液質量濃度為0.4 g/mL。

2.2 模型建立 根據Bui等[12]報道的方法建立，并稍加改進。小鼠在第1天腹腔注射致敏液(0.2 mL/只，含50 μg OVA、1 mg 氫氧化鋁凝膠)，第14天再腹腔注射致敏液(0.2 mL/只，含50 μg OVA)，第27～29天以5%OVA 溶液霧化激發，每次20 min。正常組小鼠給予同體積PBS致敏霧化。

2.3 分組與給藥 72只小鼠實驗前適應性飼養1周，根據體質量隨機分成6組，每組12只，分別為正常組、OVA模型組、地塞米松組及黑種草保健茶低、中、高劑量組，正常組小鼠以PBS代替來進行致敏和霧化激發，其他5組按“2.2”項下方法構建模型，第15～26天各組進行12 d的藥物干預，其中黑種草保健茶低、中、高劑量組劑量分別為20、40、80 mg/kg，正常組給予相同體積PBS溶液。地塞米松組給藥劑量為0.5 mg/kg，每天腹腔注射1次。

2.4 霧化現象觀察與評分 按照王慧珠等[13]報道，從霧化開始觀察10 min內小鼠的哮喘行為并打分，無抓鼻或撓癢動作記0分，抓鼻或撓癢1～3 次記1分，4～6 次記2分，7 次及7 次以上記3分；小鼠無哮喘癥狀記0分，出現輕微的哮喘癥狀記3分，出現呼吸急促、呼吸頻率明顯加快或焦躁不安等哮喘典型癥狀記6分，出現嚴重的呼吸困難(如急促點頭、腹式呼吸等哮喘癥)狀記9分。

2.5 支氣管灌洗液(BALF)收集與細胞分類計數 剪開小鼠胸腔，細線結扎右肺支氣管，從氣管插入灌洗針連接注射器，細線結扎灌洗針防止脫落和漏氣，吸取0.3 mL PBS經氣管進入左肺，反復抽吸3次，回收的液體放入EP管內收集，重復3次，以回收率>80%為合格。BALF在1 500 r/min、4 ℃下離心10 min，吸取上清液移至1.5 mL EP管中，在-20 ℃下保存，用于測定細胞因子。底部沉淀物用20 μL PBS溶液重懸，混勻，取2 μL于載玻片上，均勻涂開，晾干，迪夫快速染色液進行染色，在400倍顯微鏡下觀察拍照，每張玻片選擇3個視野，用于細胞分類與計數。

2.6 肺組織病理學觀察 剪取未灌注小鼠右肺上半部分，放入4%甲醛中固定3～5 d，石蠟包埋后切成厚度4 μm的薄片，分別進行HE、PAS、Giemsa染色，在200倍顯微鏡下觀察肺部炎癥細胞浸潤等病理變化。

2.7 BALF、肺組織中細胞因子水平測定 取小鼠未灌右肺下半部分，稱定質量，加入20倍4 ℃ PBS溶液，在勻漿器中研磨成5%肺勻漿，靜置15 min，在3 500 r/min、4 ℃下離心15 min，吸取上清液，在-20 ℃ 保存待測。根據ELISA試劑盒說明書操作方法，分別檢測“2.5”項下BALF和肺組織勻漿中IL-4、IL-5、IL-13、IL-10、IL-12、IFN-γ水平，BCA試劑盒進行蛋白校正。

2.8 血清中IgE、IgG1水平測定 小鼠摘眼球取血，靜置1 h，在3 500 r/min下室溫離心 15 min，取血清，根據ELISA試劑盒說明書操作方法檢測血清中IgE、IgG1水平。

3 結果

3.1 黑種草保健茶對小鼠哮喘行為學、體質量的影響 正常組小鼠在整個實驗過程中體質量持續增長，外觀表現正常；OVA誘導使小鼠表現出煩躁易怒、抓耳撓鼻、呼吸異常、頻率高、急促等現象，經黑種草保健茶水浸液干預后上述癥狀有不同程度的緩解。如表1所示，造模后藥物干預前，OVA模型組、各給藥組哮喘行為學評分均高于正常組(P<0.01)；經過12 d藥物干預后，與OVA模型組比較，黑種草保健茶組、地塞米松組小鼠哮喘行為學評分均降低(P<0.05,P<0.01)。如表2所示，第30天時與正常組比較，OVA模型組小鼠體質量降低(P<0.01)；與OVA模型組比較，黑種草保健茶組小鼠體質量有不同程度的增長，以高劑量組更明顯(P<0.05)。

表1 黑種草保健茶對小鼠哮喘行為學的影響 (分，

表2 黑種草保健茶對小鼠體質量的影響

3.2 黑種草保健茶對小鼠炎癥細胞數量的影響 如圖1所示，與正常組比較，OVA模型組小鼠BALF中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、細胞總數目增加(P<0.05，P<0.01)；給予黑種草保健茶、地塞米松后，均能不同程度降低炎癥細胞數量，以黑種草保健茶高劑量組更明顯(P<0.05，P<0.01)。

注：黑色箭頭指示中性粒細胞，紅色箭頭指示嗜酸性粒細胞，桔紅色箭頭指示單核細胞。與正常組比較，#P<0.05，## P<0.01；與OVA模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖1 黑種草保健茶對小鼠BALF中炎癥細胞數量的影響(×400)

3.3 黑種草保健茶對小鼠肺組織病理變化的影響 如圖2所示，與正常組比較，OVA模型組小鼠肺組織支氣管周圍有明顯的炎性細胞浸潤與黏液分泌，并可見支氣管壁明顯增厚的現象；相對于模型組，各給藥組小鼠炎性細胞顯著減少，支氣管壁增厚現象得到不同程度緩解，病理改變明顯減輕。PAS染色可見，與正常組比較，OVA模型組小鼠肺組織支氣管可見大量陽性杯狀細胞，表明支氣管有明顯的感染；各給藥組小鼠肺組織支氣管未見明顯的陽性杯狀細胞，均能有效抑制炎癥感染的發生。Giemsa染色發現，與正常組比較，模型組小鼠肺組織支氣管周邊出現大量單核細胞，而各給藥組小鼠肺組織支氣管周邊單核細胞數量明顯減少。

注：綠色箭頭指示炎性細胞，黑色箭頭指示杯狀細胞，紅色箭頭指示單核細胞。圖2 黑種草保健茶對小鼠肺組織病理學變化的影響(×200)

3.4 黑種草保健茶對小鼠BALF、肺組織中細胞因子水平的影響 如表3～4所示，與正常組比較，OVA模型組小鼠BALF、肺組織中與Th2型細胞因子相關的IL-4、IL-5、IL-13水平升高(P<0.01)，而與Th1型細胞因子相關的IL-12、IFN-γ水平及與Treg細胞因子相關的IL-10水平降低(P<0.01)；與模型組比較，黑種草保健茶組、地塞米松組小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13水平不同程度降低，IL-12、IFN-γ、IL-10水平不同程度上升，以黑種草保健茶高劑量組更明顯(P<0.05，P<0.01)。

表3 黑種草保健茶對小鼠BALF中細胞因子水平的影響

表4 黑種草保健茶對小鼠肺組織中細胞因子水平的影響

3.5 黑種草保健茶對小鼠血清中IgE、IgG1水平的影響 如圖3所示，與正常組比較，OVA模型組小鼠血清中IgE、IgG1水平升高(P<0.01)；與模型組比較，黑種草保健茶中劑量組小鼠血清中IgE水平降低(P<0.05)，高劑量組兩者水平均降低(P<0.05)。

注：與正常組比較，## P<0.01；與OVA模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖3 黑種草保健茶對小鼠血清中IgE、IgG1水平的影響

4 討論

家黑種草原產于南亞和西南亞，在中東地區和伊斯蘭國家應用廣泛，是傳統藥方的重要組成成分之一[14]。現代研究結果證實家黑種草具有抗炎、抗菌和抗氧化、抗腫瘤、抗缺血、抗糖尿病、免疫調節等多種藥理作用[5-7,15-16]。另外，黑種草提取物中的百里醌能抑制IL-4和OVA特異性IgE的產生，限制TNF-α和IL-1β相關基因的表達[17]，而提取物中所含二硫醌、百里醌、對二苯醌等生物化學物質能顯著提高呼吸道黏液纖毛清除率，增加呼吸清除率，具有很強的平喘功能[18-19]。甘草和小茴香廣泛應用于我國傳統方劑，研究表明甘草具有抗炎、抗氧化、抗過敏、抗菌等藥理作用[8]，小茴香具有抗病毒、抗氧化、驅蟲劑、抗菌、抗炎、祛痰、解痙等藥理作用[9]。茶葉是眾多民族偏方里的組成部分，現代研究表明，茶葉中的茶多酚、兒茶素、甲基化兒茶素、茶皂素、茶黃素等功能成分具有一定的藥理和保健作用，比如抗過敏作用[10]。本研究根據Schleicher等[11]報道的搭配比例，將家黑種草、甘草、小茴香和茶葉按照3∶1∶1∶1的比例混合制作成黑種草保健茶，采用 OVA 小鼠哮喘模型，觀察黑種草保健茶水浸液對過敏性哮喘的抑制作用。結果顯示，黑種草保健茶不僅能明顯緩解哮喘行為、改善哮喘小鼠體質量增長緩慢的現象，顯著降低BALF中炎癥細胞的數量，而且顯著降低血清中IgE 和IgG1水平，顯著減輕肺組織病理學變化，包括減少肺組織中炎性細胞數量、緩解支氣管壁增厚的現象等。與此同時，黑種草保健茶能顯著降低哮喘小鼠BALF和肺組織中Th2細胞因子水平，提高Th1和Treg細胞因子水平。

眾所周知，哮喘是氣道炎癥性疾病，T細胞和嗜酸粒細胞是主要參與的2類重要炎性細胞[20]。BALF和肺組織中炎性細胞數量及其變化能直接反應哮喘的發生程度及其變化趨勢[21]，黑種草保健茶能明顯降低BALF和肺組織中炎性細胞數量，對于減緩哮喘加重有重要作用。研究表明，CD4+T細胞主要受Th1和Th2細胞因子以及Treg細胞的調節[22-23]。IL-12和IFN-γ 是典型的Th1型細胞因子，具有活化巨噬細胞的作用。Th2 細胞反應與炎癥密切相關，其主要分泌的IL-4、IL-5和IL-13能誘發T細胞增殖，促使未成熟的T細胞分化為Th2細胞，同時介導B細胞合成IgE和IgG1以及嗜酸性粒細胞浸潤[24]。IL-10是Treg細胞分泌的主要細胞因子，具有抑制多種炎癥介質合成的作用，能有效減輕氣道炎癥和氣道高反應的相應癥狀，改善炎癥類疾病[25]。Th1和Th2存在明顯的相互調節關系，支氣管哮喘的典型特征之一是Th2反應增強Th1反應減弱導致Th1/Th2失衡[26]。而Treg細胞能有效抑制Th2反應[27]，從而調節Th1/Th2的平衡。本研究發現，黑種草保健茶通過增加哮喘小鼠BALF和肺組織中Th1型白介素(IL-12、IFN-γ)和Treg(IL-10)的分泌，從而抑制Th2型白介素(IL-4、IL-5、IL-13)的分泌，調節Th1/Th2/Treg的失衡，進而減少血液中IgE和IgG1的合成，減緩BALF和肺組織中嗜酸性粒細胞等炎性細胞的浸潤來達到治療哮喘的目的。