基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探析玉液湯對(duì)2型糖尿病的作用機(jī)制

劉堅(jiān)輝， 陳楚儀， 楊幃勛， 劉 敏

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405；3.東莞仁康醫(yī)院，廣東 東莞 523952)

2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)是以胰島素抵抗和(或)胰島素分泌障礙引起的一組以葡萄糖和脂肪代謝紊亂，血漿葡萄糖水平增高為特征的代謝內(nèi)分泌疾病。目前對(duì)于T2DM的治療主要有以下方式：飲食治療、運(yùn)動(dòng)療法、口服抗糖尿病藥、胰島素治療，GLP-1類似物及減肥手術(shù)為主。中醫(yī)方面，糖尿病當(dāng)屬于中醫(yī)“消渴病”范疇，其以“三多一少”即飲多、食多、尿多、身體消瘦為特點(diǎn)，辯證當(dāng)屬“氣陰兩虛”，病位在肺、脾、腎三臟，治療當(dāng)以“益氣生津”為主。

玉液湯出自清代名醫(yī)張錫純所著的《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》[1]，用以治療消渴病，張氏于書中描述此方配伍說(shuō)：“消渴一證，多由于元?dú)獠簧朔侥松獨(dú)庖灾箍收咭病７街幸渣S芪為主，得葛根能升元?dú)狻６肿粢陨剿帯⒅浮⒒ǚ垡源笞陶骊帲怪?yáng)升而陰應(yīng)，自有云行雨施之妙也。用雞內(nèi)金者，因此證尿中皆含有糖質(zhì)，用之以助脾胃強(qiáng)健，化飲食中糖質(zhì)為津液也。用五味者，取其酸收之性，大能封固腎關(guān)，不使水飲急于下趨也。”明確提出玉液湯用以治療消渴病。而在臨床應(yīng)用上，玉液湯已被廣泛用以治療糖尿病以及其所引起的包括糖尿病腎病在內(nèi)的并發(fā)癥。

但由于復(fù)方中藥成分多樣性，以及與人體相互作用機(jī)制復(fù)雜的問(wèn)題，目前發(fā)掘其明確的作用機(jī)制仍相對(duì)困難。故希望借助近年發(fā)展迅速的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，基于系統(tǒng)生物學(xué)的角度挖掘玉液湯治療2型糖尿病的作用機(jī)理，為以后進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)提供參考基礎(chǔ)。

1 方法

1.1 收集玉液湯的生物信息數(shù)據(jù) 利用BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)收集玉液湯的相關(guān)成分及靶點(diǎn)數(shù)據(jù)。BATMAN-TCM是在線生物信息分析工具，主要用于分析中藥成分及潛在靶點(diǎn)，且該數(shù)據(jù)庫(kù)可輸入單味中藥或者以君臣佐使形式輸入中藥復(fù)方進(jìn)行分析以及對(duì)復(fù)方中藥或單味藥進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析。本次研究以玉液湯作為研究對(duì)象，輸入山藥、黃芪作為君藥，知母、天花粉作為臣藥，雞內(nèi)金、五味子、葛根作為佐使藥，一共3個(gè)集群，設(shè)定P≤0.05，score cutoff≥20為檢索條件。并將得出的與玉液湯相關(guān)的化合物成分輸入中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)，通過(guò)口服利用度(Oral Bioavailability，OB)，類藥性(Drug-Likeness，DL)作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)定OB≥30%，DL≥0.18，得出玉液湯的生物信息集[2]。

1.2 獲取2型糖尿病的生物信息數(shù)據(jù) 在DrugBank(https://www.drugbank.ca/)上輸入“type 2 diabetes mellitus”尋找2型糖尿病的相關(guān)基因，并運(yùn)用UniPort(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化命名。

1.3 獲取玉液湯-2型糖尿病-基因數(shù)據(jù) 通過(guò)OmicShare平臺(tái)(https://www.omicshare.com/)對(duì)獲得的玉液湯靶點(diǎn)以及2型糖尿病的相關(guān)基因進(jìn)行映射分析，得出玉液湯-2型糖尿病-基因數(shù)據(jù)集，并繪制韋恩圖。將玉液湯-2型糖尿病-基因數(shù)據(jù)集輸入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)，設(shè)定綜合分?jǐn)?shù)>0.4，刪除無(wú)連接的節(jié)點(diǎn)為篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析，并將得出的數(shù)據(jù)錄入Cytoscape 3.6.1軟件進(jìn)行可視化分析，對(duì)其進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)分析，得出作用顯著的節(jié)點(diǎn)。

1.4 基因本體(GO)分析 將玉液湯-2型糖尿病-基因數(shù)據(jù)集導(dǎo)入DAVID 6.8 數(shù)據(jù)(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行GO分析，得出結(jié)論后，以P≤0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，從而得出基因的功能水平。

1.5 京都基因與基因組百科全書(KEGG)分析 將玉液湯-2型糖尿病-基因數(shù)據(jù)集導(dǎo)入DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行KEGG分析，以P≤0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，從而得出其富集的生物學(xué)通路。

2 結(jié)果

2.1 玉液湯的生物信息數(shù)據(jù) 經(jīng)過(guò)BATMAN-TCM檢索后，剔除無(wú)效成分，共得到293個(gè)化合物，由于化合物較多，故錄入TCMSP篩選后只顯示各個(gè)群集OB≥30%、DL≥0.18的化合物，見表1。玉液湯的主要生物通路富集在視黃醇代謝，鈣信號(hào)通路，心肌細(xì)胞腎上腺素能信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，糖酵解/糖異生，逆行內(nèi)源性大麻素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，谷氨酸能突觸，酪氨酸代謝，甲狀腺激素信號(hào)途徑，神經(jīng)活性配體-受體相互作用，多巴胺能突觸，脂肪酸降解，膽堿能突觸，晝夜夾帶，心肌收縮，催產(chǎn)素信號(hào)通路，cGMP-PKG信號(hào)通路，胰島素分泌，γ-氨基丁酸能突觸，5-羥色胺能突觸；分子功能(Molecular function，MF)主要富集在轉(zhuǎn)錄因子活性，蛋白質(zhì)結(jié)合，信號(hào)傳感器活動(dòng)，脂質(zhì)結(jié)合，氧化還原酶活性，轉(zhuǎn)移酶活性，轉(zhuǎn)移酰基等；細(xì)胞組分(Cellular component，CC)主要富集在胞漿，質(zhì)膜，核染色體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，過(guò)氧化物酶體等；生物過(guò)程(Biological process，BP)主要富集在蛋白質(zhì)靶向，細(xì)胞骨架依賴性細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)程，蛋白質(zhì)復(fù)合物組裝，trna代謝過(guò)程等。網(wǎng)絡(luò)所示為OB≥30%、DL≥0.18的化合物與靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。

表1 玉液湯中具有較好口服利用度及類藥性的化合物

圖1 玉液湯中OB≥30%、DL≥0.18的化合物網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖(粉紅色代表化合物，綠色代表靶點(diǎn))

本次通過(guò)BATMAN-TCM檢索篩選后，共得出1 680個(gè)靶點(diǎn)，以君，臣，佐使形式分為3個(gè)合集，共同靶點(diǎn)403個(gè)，見圖2，對(duì)其進(jìn)行PPI互作網(wǎng)絡(luò)分析以及拓?fù)鋵W(xué)分析后，發(fā)現(xiàn)其相互作用較強(qiáng)的靶點(diǎn)為胰島素、白細(xì)胞介素6、腫瘤壞死因子、FOS蛋白、多巴胺受體D2等，進(jìn)一步說(shuō)明玉液湯是通過(guò)多靶點(diǎn)協(xié)同作用發(fā)揮治療疾病的作用,見表2。

表2 玉液湯君、臣、佐使的共同基因PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析

2.2 2型糖尿病的生物信息數(shù)據(jù) 通過(guò)DrugBank對(duì)“type 2 diabetes”進(jìn)行檢索以及通過(guò)Uniport對(duì)靶基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化命名后，得到197個(gè)基因，刪除重復(fù)基因后，共得到108個(gè)基因與2型糖尿病相關(guān)，其生物信號(hào)通路主要富集于視黃醇代謝、藥物代謝-細(xì)胞色素p450、膽汁分泌、細(xì)胞色素p450對(duì)外源物質(zhì)代謝的影響、5-羥色胺能突觸、神經(jīng)活性配體-受體相互作用。分子功能(Molecular function，MF)主要富集在atp酶活性與物質(zhì)跨膜運(yùn)動(dòng)，氧結(jié)合，類固醇羥化酶，藥物結(jié)合，陰離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)atp酶活性等；生物過(guò)程(Biological process，BP)主要富集在藥物反應(yīng)，外源代謝過(guò)程，類固醇代謝過(guò)程，陰離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，藥物代謝過(guò)程等；細(xì)胞組分(Cellular component，CC)主要富集于質(zhì)膜的整體組成，質(zhì)膜，細(xì)胞器膜，膜的整體組成，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等,見圖3。

注：左圖為玉液湯的君、臣、佐使的各項(xiàng)基因靶點(diǎn)數(shù)，右圖為玉液湯的君、臣、佐使的共同基因PPI網(wǎng)絡(luò)集。圖2 玉液湯的基因靶點(diǎn)集

圖3 2型糖尿病的基因靶點(diǎn)集

2.3 玉液湯-2型糖尿病-基因數(shù)據(jù) 將玉液湯的1 680個(gè)靶點(diǎn)與2型糖尿病的108個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入OmicShare平臺(tái)進(jìn)行映射，共得出交集基因61個(gè)，將其錄入STRINGpingt進(jìn)行蛋白與蛋白PPI互作分析，并運(yùn)用Cytoscape的NetworkAnalyzer功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，得出其較關(guān)鍵的基因?yàn)榘椎鞍?ALB，Degree為21)、細(xì)胞色素P4503A4(CYP3A4，Degree為20)、單胺氧化酶(MAOB，Degree為20)、SLCO1B1基因、三磷酸腺苷結(jié)合盒運(yùn)轉(zhuǎn)體A1(ABCA1，Degree為15)等。如圖4所示，節(jié)點(diǎn)顏色越深，則代表該節(jié)點(diǎn)的度(degree)越高，代表其在PPI網(wǎng)絡(luò)中起著更關(guān)鍵的作用，其中三角形節(jié)點(diǎn)代表玉液湯-2型糖尿病的共同基因靶點(diǎn)，邊代表基因間的相互作用關(guān)系，玉液湯-2型糖尿病-基因的PPI互作網(wǎng)絡(luò)共有節(jié)點(diǎn)60個(gè)及248個(gè)相互作用聯(lián)系。

注：左圖為玉液湯-2型糖尿病相互交聯(lián)的基因靶點(diǎn)數(shù)，右圖為玉液湯-2型糖尿病相互交聯(lián)的基因靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)(顏色越深，作用越強(qiáng))。圖4 玉液湯-2型糖尿病-基因的數(shù)據(jù)集分析

2.4 玉液湯-2型糖尿病-基因的生物學(xué)過(guò)程 將玉液湯-2型糖尿病的交集基因錄入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO分析，并以P≤0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，得出結(jié)果后，按照其顯性程度進(jìn)行部分排列展示，GO分析提示玉液湯-2型糖尿病-基因主要的生物學(xué)過(guò)程顯著富集在藥物反應(yīng)、腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素能受體信號(hào)通路、磷脂酶c激活g蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)途徑、藥物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、行為調(diào)節(jié)、5-羥色胺受體信號(hào)通路、突觸傳遞，多巴胺能、可卡因的行為反應(yīng)、去甲腎上腺素腎上腺素血管收縮與系統(tǒng)性動(dòng)脈血壓的調(diào)節(jié)、游離鈣離子在胞漿中的釋放、血管收縮等；分子功能主要富集在藥物結(jié)合、血清素結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、G蛋白偶聯(lián)5-羥色胺受體活性、多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、多巴胺結(jié)合、atp酶活性與物質(zhì)跨膜運(yùn)動(dòng)等；細(xì)胞組分主要富集在質(zhì)膜的整體組成、質(zhì)膜等，見表3。

表3 玉液湯-2型糖尿病-基因的生物學(xué)過(guò)程

2.5 玉液湯-2型糖尿病-基因的生物學(xué)通路 將玉液湯-2型糖尿病的交集基因錄入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG分析，共得到24條通路，并以P≤0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，得出結(jié)果后，按照其顯性程度進(jìn)行部分排列展示，見表4。KEGG分析提示玉液湯-2型糖尿病-基因主要的生物學(xué)過(guò)程顯著富集在神經(jīng)活性配體-受體相互作用、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體信號(hào)通路、膽汁分泌、5-羥色胺能突觸、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、鈣信號(hào)通路等。

表4 玉液湯-2型糖尿病-基因的生物學(xué)通路

3 討論

本研究通過(guò)BATMAN-TCM檢索獲得玉液湯化學(xué)成分108種、靶點(diǎn)1 680個(gè)，可能與視黃醇代謝、藥物代謝-細(xì)胞色素p450、膽汁分泌、細(xì)胞色素p450對(duì)外源物質(zhì)代謝的影響、5-羥色胺能突觸、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等有關(guān)，可發(fā)揮協(xié)同作用以調(diào)控2型糖尿病。

3.1 玉液湯具有調(diào)節(jié)關(guān)鍵靶點(diǎn)的潛在作用 本研究通過(guò)PPI蛋白互作網(wǎng)分析，得出玉液湯中蛋白互作性較強(qiáng)的靶點(diǎn)。其中ABL是2型糖尿病早期診斷、病情進(jìn)展和監(jiān)測(cè)的重要指標(biāo)，2型糖尿病腎臟損傷越大，其ALB丟失則越多[3]；CYP3A4是細(xì)胞色素P540氧化酶家族成員之一，隨2型糖尿病胰島素抵抗的增強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致CYP3A4蛋白活性下降[4]；MAOB是存在于胰島當(dāng)中的酶，2型糖尿病β細(xì)胞中其表達(dá)顯著降低，導(dǎo)致β細(xì)胞功能障礙[5]；SLCO1B1是溶質(zhì)載體有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體家族成員之一，其基因多態(tài)性對(duì)藥物代謝、治療效果及相關(guān)不良反應(yīng)方面有影響[6]；ABCA1可影響胰島β細(xì)胞，是維持正常胰島素分泌的關(guān)鍵作用，對(duì)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)與高密度脂蛋白生成起重要作用，膽固醇可能抑制胰島素分泌[7]。

3.2 玉液湯在調(diào)節(jié)生物學(xué)通路方面的作用 對(duì)玉液湯與2型糖尿病的共同基因進(jìn)行KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)該方對(duì)神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，有促炎、抗炎作用，對(duì)2型糖尿病的發(fā)展和治療有直接作用[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，PPARs能調(diào)控脂質(zhì)代謝過(guò)程，也調(diào)節(jié)糖代謝，與脂肪酸代謝、脂肪酸β氧化和轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)脂質(zhì)平衡有關(guān)[9]。膽汁酸是影響血糖穩(wěn)定的重要因素，除了影響脂肪的消化和吸收外，在大腸及小腸中可誘導(dǎo)2型糖尿病藥物的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)胰高血糖素樣肽-1的分泌，調(diào)節(jié)腸道微生物菌群的組成，減少2型糖尿病患者餐后血糖的上升[10]。通過(guò)KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，玉液湯作用于膽汁分泌通路，對(duì)2型糖尿病的調(diào)控亦與5-羥色胺能突觸有關(guān)。有研究證明，胰島素分泌代謝亦受到了5-羥色胺等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)控制[6]，其中ABCA1轉(zhuǎn)運(yùn)體與糖尿病發(fā)病機(jī)制有關(guān)，小鼠胰島β細(xì)胞中缺失ABCA1后，出現(xiàn)了葡萄糖不耐受等情況[11]，而玉液湯可能對(duì)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)行調(diào)控，從而對(duì)2型糖尿病起調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)，玉液湯對(duì)2型糖尿病的調(diào)控亦與鈣信號(hào)通路有關(guān)，可促進(jìn)AKT活化和鈣相關(guān)的eNOS活化，并參與了調(diào)節(jié)AKT2B1抑制HUVECs的胰島素敏感性[12]。

綜上所述，玉液湯具體多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，可能透過(guò)調(diào)控ALB，CYP3A4，MAOB，SLCO1B1， ABCA1等多個(gè)靶點(diǎn)，以及作用于神經(jīng)活性配體-受體相互作用、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體信號(hào)通路、膽汁分泌、5-羥色胺能突觸、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、鈣信號(hào)通路等多條通路對(duì)2型糖尿病起到治療作用。但鑒于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的局限性，本研究未發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)與通路的正負(fù)調(diào)節(jié)關(guān)系，因此仍需進(jìn)一步探索玉液湯作用于2型糖尿病的機(jī)制。