菊三七致大鼠肝毒性血清膽汁酸的靶向代謝組學研究

李云鶴， 茍小軍， 陳 龍， 王夏雷， 李修龍， 賈益群*

(1.上海中醫藥大學科技實驗中心分析測試室，上海 201203；2.上海市寶山區中西醫結合醫院中心實驗室，上海 201900)

菊三七又名土三七，為菊科菊三七屬植物菊葉三七Gynurasegetum(Lour.) Merr.的根或全草，具有破血散瘀，消腫止血等功效，始載于《滇南本草》中，長期大量服用可引起肝小靜脈損傷，近年來廣受人們的關注與重視[1]。

膽汁酸(Bile acids)是以膽固醇為基本原料，在肝臟中通過一系列酶促反應合成的一類膽烷酸的總稱，是膽汁的主要成分[2]。有研究表明，機體內膽汁酸代謝與肝、腸系統密切相關，膽汁酸在合成、排泄過程中，會經過肝臟的生物生化和生物物理這兩大屏障[3]，在其代謝和排泄受阻時，就會大量淤積于肝臟中，致使肝臟受損，進而導致線粒體受損及肝細胞凋亡和壞死[4]。因此研究膽汁酸代謝變化對肝毒性中藥、肝損傷機制的研究有極其重要的意義。

代謝組學是運用多種技術手段探究生物體系中小分子代謝物的種類、數量和變化規律的一門科學[5-6]，主要基于高通量分析儀器對機體代謝產物如血漿和尿液等進行定性和定量分析[7-9]。代謝組學分為靶向和非靶向代謝組學[10]，在以往的研究中主要是以非靶向代謝輪廓分析為主，即應用各種分析技術對生物體內源性小分子代謝產物進行無歧視全掃描，以獲得大量的多維的代謝組學數據信息，尋找生物體樣本中各組分的動態變化規律；而靶向代謝組學是對特定的幾個或幾類代謝物群針對性的檢測與分析，在經過非靶向代謝組學研究發現差異代謝物后，再以標準品作為參照，利用靶向代謝組學進一步進行驗證與分析[11]。

根據課題組前期的研究，在基于LC-MS的基礎上，通過分析菊三七致肝毒性大鼠血清、肝臟和尿液中的內源性代謝物，從而得出結論，菊三七致大鼠肝毒性的作用機制可能與甘油磷脂、膽汁酸等代謝紊亂有關[12-13]。本文將進一步深入探究菊三七致大鼠肝毒性與血清膽汁酸之間的聯系。

1 材料

1.1 動物 健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質量150～170 g，采購于上海斯萊克實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK(滬)2017-0005，飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心，飼養室溫度為22～25 ℃，相對濕度45%～70%，光照周期12 h/12 h，飼養期間可自由獲取水和食物。18只SD大鼠隨機分為空白組、高劑量組、低劑量組，每組6只，高劑量組和低劑量組分別給與15、7.5 g/(kg·d)的菊三七水煎劑，連續給藥10 d。

1.2 藥材 菊三七采摘于湖北省武漢市黃陂區木蘭湖周家灣，經上海中醫藥大學中藥學院崔亞君副教授鑒定為菊科植物菊三七的根塊。根據文獻[14-15]，通過煎煮配制質量濃度為1.5 g/mL的菊三七水煎劑。

1.3 試劑 膽酸(CA，批號K1325088)、鵝去氧膽酸(CDCA，批號H1716012)、去氧膽酸(DCA，批號H1725076)、甘氨膽酸(GCA，批號H1520042)、甘氨脫氧膽酸(GDCA，批號1721065)、豬去氧膽酸(HDCA，批號K1715026)、石膽酸(LCA，批號D1712091)、牛磺膽酸(TCA，批號F1729023)、牛磺鵝去氧膽(TCDCA，批號SLBH9352)、牛磺脫氧膽酸(TUDCA，批號H1511086)、熊去氧膽酸(UDCA，批號E1715044)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCA，批號F1 218 A，大連美侖生物技術有限公司)；甘氨熊去氧膽酸(GUDCA，批號BCBM2974V，美國Sigma-Aldrich公司)；牛磺豬去氧膽酸(THDCA，批號AZ1050，臨沂艾澤拉斯生物科技有限公司)。甲醇(國藥集團有限公司，批號M1203AS，色譜純)；甲酸(上海安普實驗科技有限公司，批號3208k240，色譜純)；乙酸銨(美國霍尼韋爾有限公司，批號BCBR1129V，分析純)。

1.4 儀器 超高相色譜儀(UPLC，美國Waters公司)-三重四級桿5500 LC-MS/MS(Triple Quad，美國AB SCIEX公司)；TARGINTMVX-Ⅱ多管漩渦振蕩器(北京踏錦科技有限公司)；1730R冷凍高速離心機(德國Gene公司)；TBA-40FR全自動生化分析儀(日本Toshiba公司)；TP1020全自動脫水機、EG1160自動包埋機、RM2135切片機(德國Leica公司)；FA2004N電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；Milli-Q純水機(上海默瑞生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 生物樣品采集

2.1.1 血清 末次給藥后于晚上開始禁食12 h，第二天進行大鼠腹主動脈取血4 mL，4 ℃靜置1 h，3 500 r/min離心15 min后取上清液100 mL，于全自動生化檢測儀上檢測ALT、AST、ALB、TBIL水平。

2.1.2 肝臟組織 大鼠處死后取肝組織，分離得肝大葉立即置于10%福爾馬林溶液中固定，制備石蠟切片后進行HE染色，光鏡下觀察肝組織形態學變化。

2.2 對照品溶液配制 精密稱取各對照品5 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶液溶解至刻度線，搖勻，即得儲備液，保存于4 ℃冰箱中備用。精密移取儲備液，甲醇稀釋成500、200、100、50、20、10、5、0.5 ng/mL，用于標準曲線繪制。

2.3 樣品處理 取大鼠血清100 mL，加入300 mL甲醇，渦旋1 min后，12 000 r/min離心10 min，取上清于進樣瓶中進樣分析。

2.4 LC-MS/MS分析

2.4.1 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動相0.1%甲酸(含10 mmol/L醋酸銨)(A)-甲醇(B)，梯度洗脫(0～1.0 min，45% A；1～9 min，45%～20%A；9～11.4 min，20%～10%A；11.4～14.0 min，10%A；14.0～14.1 min，10%～45%A；14.1～17 min，45%A)；體積流量0.3 mL/min；柱溫45 ℃；進樣量2 μL。

2.4.2 質譜條件 電噴霧電離(ESI)，負離子模式，多級反應模式監測(MRM)；毛細管電壓2.8 kV；錐孔電壓55.0 V；離子源溫度120 ℃；去溶劑化溫度350 ℃；去溶劑化氣流600 L/h；錐孔氣流5.0 L/h。

3 結果

3.1 菊三七對大鼠血清生化指標影響 如表1所示，與空白組比較，高、低劑量組TBA、ALT、AST、TBIL均升高(P<0.05)，其中高劑量組ALT、TBIL均高于低劑量組(P<0.01)；而高劑量組的TBA則低于低劑量組(P<0.01)。

表1 菊三七不同給藥劑量對大鼠血清生化指標影響

3.2 肝組織病理切片 如圖1所示，空白組肝細胞正常；高劑量組肝細胞呈現大面積出血性壞死；低劑量組肝細胞有炎細胞浸潤，細胞間隙變大，有少部分出血性壞死；高劑量組肝損傷程度較低劑量組更大。

圖1 大鼠肝組織HE染色病理切片(×200)

3.3 血清膽汁酸分析 在連續給藥10 d后，高、低劑量組與空白組比較結果如表2所示。隨著給藥劑量的增加，部分膽汁酸的濃度有著明顯的上升趨勢，其中高、低劑量組的CA、CDCA、GCA、GUDCA、TCA、TCDCA、TUDCA、THDCA都升高(P<0.05)；高劑量與低劑量比較，CA、CDCA、DCA、HDCA、TCDCA、TUDCA、THDCA均有差異(P<0.05)，且低劑量組比高劑量組至少升高2到3倍以上。以上結果表明，在一定的天數內隨著給藥劑量的增加，高、低劑量組血清中部分膽汁酸都升高，但低劑量組血清膽汁酸水平更高，這與低劑量的TBA高于高劑量的結果一致，提示菊三七致肝毒性與以上膽汁酸水平有一定的相關性。

表2 菊三七不同給藥量下14種血清膽汁酸水平

3.4 多元分析

3.4.1 PCA分析 采用非監督模式的PCA分析方法，將空白組和高、低劑量組進行比較分析，以膽汁酸濃度為X變量，組別為Y組，如圖2所示。高、低劑量組和空白組經PCA分析能較完全分離，提示大鼠血清中14種膽汁酸已發生代謝紊亂。圖2中空白組與低、高劑量組比較，R2X分別為0.605、0.627、0.659、0.612，說明該PCA模型能解釋樣本間代謝差異。

圖2 大鼠血清膽汁酸樣本PCA分析

3.4.2 OPLS-DA分析 為反應不同組別之間的差異關系，更好地對模型進行解釋，進一步采用監督性的正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)，本分析對模型進行200次置換檢驗，分別對大鼠血清膽汁酸樣本構建OPLS-DA模型，對高、低劑量組和空白組之間進行模型分析，結果如圖3所示，空白組與高、低劑量組在OPLS-DA圖上能完全分離，方便下一步差異代謝物的尋找。根據計算結果顯示，圖3中R2Y分別為0.966、0.956、0929，Q2分別為0.874、0.899、0.504，表明該模型的擬合度和預測能力較好。

圖3 大鼠血清膽汁酸樣本OPLS-DA得分圖及其置換檢驗

3.5 篩選差異代謝物 通過上述OPLS-DA的分析結果，根據變量權重值VIP>1的標準進行篩選，并結合P<0.05的標準，篩選差異代謝物。高劑量組與空白組比較，差異代謝物有5個，分別為DCA、TCA、TCDCA、TUDCA和THDCA；低劑量組與空白組比較，差異代謝物有7個，分別為CDCA、GCA、GUDCA、TCA、TCDCA、TUDCA和THDCA；高劑量組與低劑量組比較，差異代謝物有5個，分別是CDCA、DCA、HDCA、TUDCA和THDCA。

4 討論

膽汁酸代謝在肝損傷疾病的發生與發展中有著越來越重要的作用，是用于診斷肝功能及肝臟疾病的一類敏感的標志物[16]。Márcia等[17]通過研究發現脂肪性肝炎患者體內的CA、CDCA和DCA水平顯著性升高。而膽汁酸是一類雙親性分子，可分為疏水性和親水性，其中疏水性膽汁酸主要有CA、CDCA、DCA、LCA和GCDCA[18]。有研究認為疏水性膽汁酸蓄積可促進肝細胞損傷、凋亡或壞死[19]。本實驗通過檢測大鼠血清中14種膽汁酸的水平，探究不同劑量下大鼠血清膽汁酸的變化。結果表明，在一定時間內，隨著給藥劑量升高，菊三七致肝毒性也逐漸增強，其中DCA、CDCA在大鼠血清中濃度顯著增高，與文獻報道結論一致。可推測菊三七給藥已造成大鼠肝損傷，同時引起肝臟吸收和排泄功能障礙，最終使得血清中膽汁酸濃度升高。加上DCA、CDCA為疏水性膽汁酸會進一步加重肝損傷，從而導致肝細胞的凋亡或壞死。給藥后大鼠血清膽汁酸升高，進一步推測菊三七致大鼠肝損可能是與膽汁酸在體內淤積有關，通過病理切片的觀察，可知在一定的時間下，菊三七給藥量和肝損傷嚴重程度成正比關系。

雖然高、低劑量組的膽汁酸濃度均高于空白組，但高劑量組的血清膽汁酸濃度均低于低劑量組，且生化指標TBA的檢測中發現，高劑量組的TBA值同樣比低劑量組的低，由此猜測可能是由于高劑量組對大鼠肝損傷較為嚴重，反而抑制了體內膽汁酸的合成，這與陳楚穎等[20]研究中發現當膽汁酸水平上升后會反饋性調控膽汁酸的合成、排泄基因的表達，進而維持膽汁酸的穩態的研究結果相印證。Jia[21]等人的研究中也同樣表明膽汁酸合成會受到FXR的負反饋性調節機制的影響，正是通過這種負反饋性機制的調節從而限制了膽汁酸在肝臟中積累，提示高濃度肝毒性藥物對肝臟損害較嚴重，進而激活了體內FXR，從而導致膽汁酸合成能力下降，雖然總膽汁酸合成能力有所下降，但是體內膽汁酸水平仍高于正常組，最終造成膽汁酸淤積。

綜上所述，本文通過對大鼠血清中14種膽汁酸進行靶向代謝組學研究，發現在一定給藥時間內，不同給藥劑量的菊三七對大鼠血清中膽汁酸濃度有一定影響。應用t檢驗和多元統計分析，由結果發現CDCA、GCA、DCA、HDCA、GUDCA、TCA、TCDCA、TUDCA和THDCA在給藥菊三七后會發生一定的變化，且隨著給藥劑量增加菊三七肝毒性也在增加，提示這些膽汁酸可作為菊三七致大鼠肝毒性的潛在標志物。

5 結論

本實驗在前期研究基礎上，采用菊三七水煎劑灌胃給藥法建立大鼠肝損傷模型，應用LC-MS/MS對大鼠血清樣本進行14種膽汁酸水平檢測，利用代謝組學的研究方法對數據進行分析處理，找尋菊三七致肝損傷的潛在標志物。結論，菊三七致肝損傷可能與大鼠體內膽汁酸紊亂與淤積有關，通過數據分析發現大鼠給藥菊三七后，體內CDCA、GCA、DCA、HDCA、GUDCA、TCA、TCDCA、TUDCA和THDCA受影響較大，這表明這些膽汁酸可作為菊三七致大鼠肝損傷的潛在標志物。同時，該研究為毒性中藥的研究提供了新的研究思路與方法。