辛夷、辛夷仁和辛夷外苞片中非揮發(fā)性成分比較

渠亞蓉， 胡 靜， 周 琪， 張 敏， 章弘揚(yáng)， 胡 坪*

(1.華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海市功能性材料化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237；2.華東理工大學(xué)藥學(xué)院，上海市新藥設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237)

辛夷，為望春花MagnoliabiondiiPamp.、玉蘭MagnoliadenudateDesr.或武當(dāng)玉蘭MagnoliasprengeriPamp.的干燥花蕾[1]，其性溫味辛，歸肺胃經(jīng)，可以散風(fēng)寒、通鼻竅[2]。從部位角度，可將辛夷全花蕾可分為外苞片和辛夷仁兩部分。明、清之前，含有辛夷的古方中一般以辛夷仁入藥，如宋代《嚴(yán)氏濟(jì)生方》[3]所載“辛夷散”。至明、清時(shí)期，諸多含辛夷仁的經(jīng)典名方歷經(jīng)時(shí)代演變，逐步以辛夷代替辛夷仁，如《惠直堂經(jīng)驗(yàn)方》[4]中“辛夷散”。近年來(lái)，古代經(jīng)典名方的開(kāi)發(fā)受到國(guó)家高度重視，其中不乏含辛夷仁的方劑[5-6]，而辛夷仁是否能用當(dāng)前市場(chǎng)上流通的辛夷取代還值得商榷。

辛夷中的化學(xué)成分種類繁多，可分為揮發(fā)油類、生物堿類、黃酮苷類和木脂素類等[7]。其中揮發(fā)油和木脂素是辛夷的主要藥效成分[8-10]。本課題組前期已對(duì)辛夷、辛夷仁、辛夷苞片中的揮發(fā)性成分進(jìn)行對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)辛夷仁所含揮發(fā)性成分種類與辛夷一致，但含量遠(yuǎn)高于辛夷[11]。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)辛夷及辛夷仁的非揮發(fā)性成分展開(kāi)研究，建立辛夷非揮發(fā)性成分的超高效液相色譜指紋圖譜，利用LC-MS對(duì)其中的主要色譜峰進(jìn)行鑒定，結(jié)合主成分分析和PLS-DA尋找辛夷不同部位的差異性成分，旨在為經(jīng)典名方中辛夷的合理使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

Waters Acquity超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；Agilent 1290 UHPLC-6530 QTOF-MS/MS液質(zhì)聯(lián)用儀[安捷倫科技(中國(guó))有限公司]；EPED-E2-10TF實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)(南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司)；CPA225D型分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]。乙腈和甲酸均為色譜純、磷酸為分析純(上海泰坦科技有限公司)。木蘭脂素(110882-201708，中國(guó)食品藥品檢定研究院)。辛夷藥材由神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供，并經(jīng)河北省食品藥品檢驗(yàn)院孫寶惠主任中藥師鑒定為望春花MagnoliabiondiiPamp.干燥花蕾。

2 方法與結(jié)果

2.1 木蘭脂素含量測(cè)定 對(duì)來(lái)自3個(gè)不同產(chǎn)地共15批的辛夷藥材進(jìn)行手工處理，獲得對(duì)應(yīng)批次的辛夷仁和辛夷苞片，測(cè)得辛夷仁在辛夷全花蕾中所占比例約為30%～35%。木蘭脂素的含量測(cè)定參照2020年版《中國(guó)藥典》方法進(jìn)行，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析，木蘭脂素的回歸方程為Y=5 326.26X-19.162(r=0.999 9)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 15批辛夷不同部位的木蘭脂素含量(%，n=2)

2.2 辛夷UHPLC指紋圖譜建立

2.2.1 色譜條件 Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-水(含0.1%磷酸)(B)，梯度洗脫(0 min，10% A；0～16 min，10%～18%A；16～30 min，18%～55% A；30～35 min，55%～100%A；35～40 min，100% A)；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；體積流量0.2 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量1 μL。

2.2.2 溶液制備 取辛夷、辛夷仁、外苞片粗粉各約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲(500 W、40 kHz)提取50 min，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取木蘭脂素對(duì)照品適量，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加甲醇制備成質(zhì)量濃度為0.542 7 mg/mL的參照峰溶液。

2.2.3 UHPLC指紋圖譜方法學(xué)驗(yàn)證 取同一份辛夷供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，對(duì)儀器的精密度進(jìn)行考察。取同一批號(hào)的辛夷，平行制備6份供試品溶液，記錄所得色譜圖，對(duì)重復(fù)性進(jìn)行考察。取同一份供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、24 h進(jìn)樣，記錄所得色譜圖，對(duì)穩(wěn)定性進(jìn)行考察。分別計(jì)算圖1(B)中10個(gè)特征峰(1～10號(hào)峰)相對(duì)于參照峰木蘭脂素(S)的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)中，各特征峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1.0%，相對(duì)峰面積RSD均小于5.0%，方法驗(yàn)證結(jié)果符合指紋圖譜分析的要求。

注：A～C分別為辛夷仁、辛夷、辛夷外苞片。圖1 各樣品UHPLC特征圖譜

2.2.4 UHPLC指紋圖譜測(cè)定及相似度評(píng)價(jià) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，色譜圖見(jiàn)圖1。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)，計(jì)算15批辛夷全花蕾、辛夷仁和外苞片UHPLC特征圖譜與對(duì)照譜圖的相似度，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 不同部位非揮發(fā)性成分的液質(zhì)聯(lián)用定性分析

2.3.1 分析條件 液相色譜條件同“2.2.1”項(xiàng)，僅以水(含0.1%甲酸)代替水(含0.1%磷酸)作為流動(dòng)相B。采用正、負(fù)離子掃描模式；質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 500；采集一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)；霧化溫度350 ℃；霧化氣體積流量10 L/min；霧化氣壓30 psi(1 psi=6.895 kPa)；毛細(xì)管電壓正模式為3 000 V，負(fù)模式為3 500 V；Skimmer 電壓65 V；八極桿射頻電壓750 V；毛細(xì)管出口電壓150 V。目標(biāo)二級(jí)離子模式(Targeted MS/MS)的碰撞電壓值依據(jù)目標(biāo)離子碎裂的難易程度設(shè)定為20、40 eV。

2.3.2 數(shù)據(jù)處理 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液，在“2.3.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，不同模式下辛夷的總離子流圖見(jiàn)圖2。采用MassHunter Qualitative Analysis B.06.00軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜得到的精確分子量計(jì)算分子式，結(jié)合對(duì)二級(jí)質(zhì)譜裂解規(guī)律的研究，參照文獻(xiàn)[12-18]，共鑒定出21種成分，見(jiàn)表3～4，其中6種生物堿類，4種苯乙醇苷類，3種黃酮苷類，8種木脂素類。結(jié)果表明，辛夷仁中的非揮發(fā)性成分以木脂素類為主，生物堿的含量很少；而辛夷外苞片中的木脂素類含量極低，但生物堿含量顯著高于辛夷仁。

圖2 辛夷不同模式下總離子圖

表3 成分鑒定結(jié)果及二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)(正離子模式)

表4 成分鑒定結(jié)果及二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)(負(fù)離子模式)

2.4 主成分分析 以“2.2.4”項(xiàng)下獲得的15批辛夷不同部位的UHPLC指紋圖譜中各色譜峰峰面積與試樣質(zhì)量的比(色譜峰保留時(shí)間>2 min，峰面積占比≥0.4%)為特征值，利用SIMCA 13.0軟件得到的主成分分析圖見(jiàn)圖3。為找出辛夷不同部位間的差異性特征成分，還進(jìn)行了偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)，依次提取4種主成分，分別生成載荷散點(diǎn)圖和VIP值圖，見(jiàn)圖4～5。

注：圖中菱形為辛夷仁，方形為辛夷，圓形為辛夷苞片。圖3 辛夷、辛夷仁和辛夷苞片主成分分析得分圖

圖4 辛夷、辛夷仁和辛夷苞片PLS-DA載荷散點(diǎn)圖

圖5 辛夷、辛夷仁和辛夷苞片VIP值圖

3 討論

3.1 不同部位中木蘭脂素含量的比較 由表1可見(jiàn)，木蘭脂素在辛夷仁中的平均含量為10.30%，遠(yuǎn)高于其全花蕾和外苞片。可見(jiàn)辛夷仁部位是辛夷全花蕾中木蘭脂素的主要來(lái)源部位。

3.2 不同部位指紋圖譜的相似度分析 由表2可知，辛夷仁的指紋圖譜相似度在0.931～0.967之間，與辛夷全花蕾和外苞片相比較高，說(shuō)明這15批辛夷仁的質(zhì)量較為一致。而外苞片的相似度偏低，在0.361～0.564之間，提示該部位與另2個(gè)藥用部位的質(zhì)量存在較大差異。

3.3 不同部位UHPLC指紋圖譜的差異分析 由辛夷、辛夷仁和辛夷外苞片的UHPLC指紋圖譜(圖1)可知，三者所含非揮發(fā)性成分的種類基本一致，但同一成分的含量在不同部位差異顯著。2～10 min的色譜峰在辛夷仁中峰高較低，在外苞片中的峰高較高，例如特征性較強(qiáng)的3號(hào)色譜峰木蘭堿(圖2中的5號(hào)峰)。而30～40 min的色譜峰在辛夷仁部位中的峰高要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于外苞片及全花蕾部位，例如對(duì)照峰木蘭脂素，這與“2.1”項(xiàng)下木蘭脂素含量測(cè)定結(jié)果具有一致性。

3.4 不同部位非揮發(fā)性成分的主成分分析 15批辛夷不同部位的PCA得分圖中，辛夷、辛夷仁和辛夷苞片的數(shù)據(jù)分布在3個(gè)相對(duì)獨(dú)立的區(qū)域，提示這3種不同部位的非揮發(fā)性物質(zhì)在成分含量上存在明顯差異，證明辛夷仁藥材有別于辛夷全花蕾。這與本課題組之前對(duì)辛夷不同部位揮發(fā)性成分的PCA分析結(jié)果[11]相似。

在載荷散點(diǎn)圖圖4中，有4個(gè)成分與主要化合物團(tuán)偏離最遠(yuǎn)，表明這4個(gè)成分在樣本分類中的作用最大。本模型的VIP值如圖5所示，該數(shù)值代表變量重要性投影值，VIP值越高，代表該變量化合物對(duì)辛夷及其不同部位質(zhì)量差異的貢獻(xiàn)越大，因此VIP值最高(VIP>1.6)的4個(gè)非揮發(fā)性成分——木蘭脂素、D-烏藥堿、松脂素二甲醚和木蘭堿即為辛夷仁和辛夷外苞片間的差異性成分。

有研究者指出，辛夷的入藥成分主要為木蘭脂素和松脂素二甲醚等木脂素類化合物[18]。亦有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示，辛夷中的酚酸性生物堿如柳葉木蘭堿、木蘭箭毒堿等均存在箭毒樣作用，且多會(huì)經(jīng)腸道緩慢吸收，存在一定毒性[12]。因此，從物質(zhì)基礎(chǔ)的角度考慮，去除富含酚酸性生物堿的外苞片，僅以木脂素類成分含量更高的辛夷仁入藥，不僅可避免苞片茸毛的刺激，還能降低毒性風(fēng)險(xiǎn)，提高藥效。經(jīng)典名方中以辛夷仁入藥有其合理性和科學(xué)性。