響應面法優化高壓均質破碎重組大腸桿菌的條件

游思亮 王裔娜 田瑞平 王青

摘要：通過單因素試驗，分析了均質壓力、均質次數和菌液濃度3個因素對大腸桿菌蛋白破碎率的影響。然后利用響應面試驗擬合出大腸桿菌蛋白破碎率的回歸方程，優化了高壓均質法破碎大腸桿菌的試驗條件。結果表明，各因素對大腸桿菌蛋白破碎率影響順序為均質次數（B）>均質壓力（A）>菌液濃度（C）。在均質壓力140 MPa、均質次數4次、菌液濃度60 g/L時，大腸桿菌蛋白破碎率達到最高，為13.98%。

關鍵詞：響應面;高壓均質;蛋白破碎率;大腸桿菌

中圖分類號： S182? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）17-0071-04

收稿日期：2021-01-10

基金項目：國家自然科學基金（編號：31801350）。

作者簡介：游思亮（1984―），男，湖北武漢人，碩士，實驗師，主要從事大型儀器設備管理和功能開發。E-mail：yousl@njau.edu.cn。

在生物學領域，經過改造過的細菌系統經常用來表達各種外源重組產物，如蛋白質、酶和抗體，大腸桿菌（Escherichia coli，簡稱E. coli）是其中最常見的寄主材料。這主要是由其特點決定的，大腸桿菌表達系統具有遺傳背景清楚、繁殖快、培養成本低、表達量高、表達產物容易純化、穩定性好、抗污染能力強以及適用范圍廣等優勢[1]。

但是重組蛋白通常在大腸桿菌細胞內部表達，不能被大腸桿菌分泌到細胞外部，要提取純化蛋白還需要將大腸桿菌細胞破碎[2]。目前，用于提取大腸桿菌外源蛋白的常用細胞破碎方法主要有高壓均質法、珠磨法、超聲波破碎法、滲透壓法、反復凍融法、酶解法和化學降解法[3-8]。高壓均質法破碎細胞的原理是在高壓條件下使溶液通過均質閥，溶液內細胞經過閥門的撞擊力、通道內高速流體剪切力和瞬時壓力差3個不同的作用力后被破碎，釋放胞內物質達到細胞破碎的目的[9]。高壓均質法作為一種物理破碎方式，具有破碎效率高[3-4]、無試劑消耗和污染[5]、可用于工業化生產等諸多優點[10]，正在被越來越多的研究者采用。

有學者利用高壓均質法研究破碎大腸桿菌的試驗條件[7]，但主要是探討單個因素對破碎結果的影響，沒有考慮到因素之間的交互作用，也沒有探討最優化的試驗條件。本研究在單因素試驗的基礎上，利用響應面法探討因素之間的交互作用以及最優化的試驗條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：E. coli DH5α為南京農業大學小麥研究所保存，重組質粒pCold-10477為小麥研究所構建，按常規方法轉化獲得相應重組工程菌。

試劑：蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、瓊脂糖、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、卡那霉素、二硫蘇糖醇（DTT），購自Sigma公司;Bradford蛋白質濃度檢測試劑盒，購自上海碧云天生物公司;PBS緩沖液（pH值7.2），購自英濰捷基公司。

儀器：高壓均質機（JN-Mini，廣州聚能納米公司）、酶標儀（Infinite200，TECAN）、離心機（CR21，Hitachi）、搖床（Ks4000，IKA）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌液的培養和收集 重組基因的E. coli DH5α工程菌采用兩步法培養，取3 μL重組工程菌液接種到3 mL新鮮LB培養基（含50 μg/mL卡那霉素） 中，于37? ℃、220 r/min過夜培養15 h獲得種子液。隨后將種子也按照1%比例接種到新鮮LB培養基（含50 μg/mL卡那霉素）中，37 ℃、220 r/min 繼續培養至D600 nm達到0.6左右，加誘導劑后繼續16 ℃，150 r/min振蕩培養15 h。每 100 mL 誘導后的菌液于10 000 r/min 離心5 min，收集菌體，加入預冷的PBS緩沖液（pH值7.2） 50 mL 洗滌1次，然后加入預冷的PBS緩沖液 15 mL，充分懸浮，懸浮液置于-4 ℃待用。

1.2.2 菌液濃度測定 當菌液在600 nm時的吸光度值D600 nm小于0.7時，D600 nm與菌液濃度呈線性關系[11]，可用來監測菌體生長情況，濃縮之后的菌液濃度用每升菌液中菌體濕質量（g/L）表示。

1.2.3 蛋白質濃度標準曲線的繪制 破碎之后上清液中可溶性蛋白的濃度用Bradford染色法測得[12]。將蛋白標準溶液分別稀釋成1.500、1.000、0.750、0.500、0.250、0.125 mg/mL的濃度梯度，然后分別取5 μL不同濃度的蛋白標準溶液到96孔酶標板，每個孔各加250 μL的G250染色液，反應 5 min 后，用酶標儀測定595 nm處的吸光度，重復3次，得到標準曲線的方程為y=0.632 9x+0.532 5，相關系數r2=0.992 3，表明標準曲線相關性很好，可用于檢測樣品的蛋白質濃度。

1.2.4 蛋白破碎率的測定 用上清液中可溶性蛋白的濃度與菌體濃度的比值表示蛋白破碎率。

1.2.5 單因素試驗設計 根據已有研究[7]，選取高壓均質過程中關鍵影響因素均質壓力、均質次數、菌液濃度，設計單因素試驗，研究每個因素對破碎結果的影響，試驗方案如下：（1）在菌液濃度為100 g/L，均質次數為3次時，分別用80、100、120、140、160 MPa均質壓力破碎菌液，分析均質壓力對大腸桿菌破碎結果的影響。（2）在均質壓力為 120 MPa，菌液濃度為100 g/L時，分別均質1、2、3、4、5次，分析均質次數對大腸桿菌破碎結果的影響。（3）在均質壓力為120 MPa，均質次數為3次時，分別用60、80、100、120、140 g/L濃度的菌液進行破碎，分析菌液濃度對大腸桿菌破碎結果的影響。

1.2.6 響應面試驗設計 根據單因素試驗結果，利用Design Expert V8.0.6軟件中Box-Behnken試驗設計方法，以均質壓力（A）、均質次數（B）、菌液濃度（C）為試驗因素，以蛋白破碎率為響應值設計三因素三水平響應面試驗，并用方程對結果進行擬合及優化，各因素及水平見表1所示。

1.3 數據處理

單因素試驗每個試驗點做3次重復，使用Excel 2016處理數據及制作圖表。響應面結果用Design Expert V8.0.6進行擬合，方差分析并優化參數。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 不同均質壓力對破碎結果的影響 由圖1可知，在均質壓力達到120 MPa之前，隨著壓力的增大，大腸桿菌蛋白破碎率明顯升高，100 MPa和 120 MPa 處理之間差異達到顯著水平（P<0.05）。當均質壓力達到120 MPa之后，隨著均質壓力上升，大腸桿菌蛋白破碎率緩慢升高，但是處理之間差異不顯著，說明壓力達到120 MPa時，樣品的破碎已經接近完成，升高壓力對結果的影響已經不明顯，因此，選用的均質壓力為120 MPa。

2.1.2 不同均質次數對破碎結果的影響 由圖2可知，樣品破碎前期（次數≤3）增加均質次數可以顯著提高大腸桿菌蛋白破碎率，處理之間差異達到顯著水平（P<0.05）。但是均質3次之后，繼續增加均質次數，結果的增加幅度明顯放緩，均質3、4和5次處理之間差異均不顯著。過長時間的破碎有可能導致釋放出的蛋白質降解，并且考慮時間成本，選擇的均質次數為3次。

2.1.3 不同菌液濃度對破碎結果的影響 由圖3可知，隨著菌液濃度的提高，大腸桿菌的蛋白破碎率呈緩慢下降的趨勢，但各處理的結果基本維持在較高的水平（>9.5%），除了濃度最低的60 g/L處理，其他處理之間差異都不顯著，說明菌液濃度對大腸桿菌蛋白破碎率的影響較小。因此，選取差異不顯著的第1個處理，也就是80 g/L作為后續試驗條件。

2.2 響應面試驗結果分析

根據試驗設計，一共安排響應面試驗15組，試驗順序及結果如表2所示。通過軟件對結果進行二元多次回歸擬合，得到蛋白破碎率的回歸方程為Y=11.55+0.82A+1.5B+0.18C-0.38AB-0.59AC+0.055BC+0.25A2-0.12B2+0.062C2。該回歸方程模型的P模型=0.000 8<0.01，表明模型極顯著;失擬項p失擬=0.155 4>0.05，表明模型失擬項不顯著;模型的確定系數R2=0.9820，調整確定系數R2adj=0.949 5，說明該模型能解釋94.95%的響應值變化，因此，該模型擬合良好，可以用此模型對最優破碎參數進行分析和預測。

從表3可知，一次項A、B達到極顯著水平（P<0.01），而C不顯著，表明均質壓力和均質次數對蛋白破碎率影響極大，菌液濃度對蛋白破碎率的影響相對不顯著。二次項中除了AC因素之間交互作用顯著外，其他因素之間交互作用都不顯著，表明因素之間的交互作用對蛋白破碎率的影響較小。而且各因素對大腸桿菌蛋白破碎率影響大小順序為均質次數（B）>均質壓力（A）>菌液濃度（C）。

通過觀察兩因素之間的響應曲面圖可以預測變量的響應值以及確定變量之間的相互關系，響應面越陡，反映兩因素之間的交互作用越顯著[13]。三因素兩兩之間的響應面曲面見圖4，可見圖4-a的響應曲面較陡，表明均質壓力和均質次數之間交互作用較顯著，對蛋白破碎率的影響較大。圖4-b、圖4-c的響應曲面較平緩，表明均質壓力與菌液濃度、均質次數與菌液濃度之間的交互作用較不顯著，對響應值的影響較小。

2.3 最優參數的確定及驗證

在選取的因素范圍內，通過DesignExpert V8.0.6軟件提取的最優條件：均質壓力140 MPa、均質次數4次、菌液濃度60 g/L，在此條件下，回歸模型預測的理論蛋白破碎率為14.04%。為了驗證預測結果的可靠性，根據預測試驗條件，經過3次重復，得到大腸桿菌實際蛋白破碎率為13.98%，這與預測值非常接近。說明該模型能較好地擬合實際情況，有一定的實踐指導意義。

3 結論

本研究通過單因素試驗，分析了均質壓力、均質次數和菌液濃度3個因素對大腸桿菌蛋白破碎率的影響。然后根據單因素試驗結果，利用響應面試驗擬合出大腸桿菌蛋白破碎率的二元多次回歸方程，各因素對大腸桿菌蛋白破碎率影響順序為均質次數（B）>均質壓力（A）>菌液濃度（C），并確定最優化的試驗參數：均質壓力140 MPa、均質次數4次、菌液濃度60 g/L，在此條件下的大腸桿菌實際蛋白破碎率為13.98%。該結果可為高壓均質法破碎大腸桿菌，提取胞內外源蛋白提供一定的方法借鑒，并適用于大規模工業生產。

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