響應(yīng)面法優(yōu)化高壓均質(zhì)破碎重組大腸桿菌的條件

游思亮 王裔娜 田瑞平 王青

摘要：通過單因素試驗，分析了均質(zhì)壓力、均質(zhì)次數(shù)和菌液濃度3個因素對大腸桿菌蛋白破碎率的影響。然后利用響應(yīng)面試驗擬合出大腸桿菌蛋白破碎率的回歸方程，優(yōu)化了高壓均質(zhì)法破碎大腸桿菌的試驗條件。結(jié)果表明，各因素對大腸桿菌蛋白破碎率影響順序為均質(zhì)次數(shù)（B）>均質(zhì)壓力（A）>菌液濃度（C）。在均質(zhì)壓力140 MPa、均質(zhì)次數(shù)4次、菌液濃度60 g/L時，大腸桿菌蛋白破碎率達到最高，為13.98%。

關(guān)鍵詞：響應(yīng)面;高壓均質(zhì);蛋白破碎率;大腸桿菌

中圖分類號： S182? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）17-0071-04

收稿日期：2021-01-10

基金項目：國家自然科學基金（編號：31801350）。

作者簡介：游思亮（1984―），男，湖北武漢人，碩士，實驗師，主要從事大型儀器設(shè)備管理和功能開發(fā)。E-mail：yousl@njau.edu.cn。

在生物學領(lǐng)域，經(jīng)過改造過的細菌系統(tǒng)經(jīng)常用來表達各種外源重組產(chǎn)物，如蛋白質(zhì)、酶和抗體，大腸桿菌（Escherichia coli，簡稱E. coli）是其中最常見的寄主材料。這主要是由其特點決定的，大腸桿菌表達系統(tǒng)具有遺傳背景清楚、繁殖快、培養(yǎng)成本低、表達量高、表達產(chǎn)物容易純化、穩(wěn)定性好、抗污染能力強以及適用范圍廣等優(yōu)勢[1]。

但是重組蛋白通常在大腸桿菌細胞內(nèi)部表達，不能被大腸桿菌分泌到細胞外部，要提取純化蛋白還需要將大腸桿菌細胞破碎[2]。目前，用于提取大腸桿菌外源蛋白的常用細胞破碎方法主要有高壓均質(zhì)法、珠磨法、超聲波破碎法、滲透壓法、反復凍融法、酶解法和化學降解法[3-8]。高壓均質(zhì)法破碎細胞的原理是在高壓條件下使溶液通過均質(zhì)閥，溶液內(nèi)細胞經(jīng)過閥門的撞擊力、通道內(nèi)高速流體剪切力和瞬時壓力差3個不同的作用力后被破碎，釋放胞內(nèi)物質(zhì)達到細胞破碎的目的[9]。高壓均質(zhì)法作為一種物理破碎方式，具有破碎效率高[3-4]、無試劑消耗和污染[5]、可用于工業(yè)化生產(chǎn)等諸多優(yōu)點[10]，正在被越來越多的研究者采用。

有學者利用高壓均質(zhì)法研究破碎大腸桿菌的試驗條件[7]，但主要是探討單個因素對破碎結(jié)果的影響，沒有考慮到因素之間的交互作用，也沒有探討最優(yōu)化的試驗條件。本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法探討因素之間的交互作用以及最優(yōu)化的試驗條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：E. coli DH5α為南京農(nóng)業(yè)大學小麥研究所保存，重組質(zhì)粒pCold-10477為小麥研究所構(gòu)建，按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化獲得相應(yīng)重組工程菌。

試劑：蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、瓊脂糖、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、卡那霉素、二硫蘇糖醇（DTT），購自Sigma公司;Bradford蛋白質(zhì)濃度檢測試劑盒，購自上海碧云天生物公司;PBS緩沖液（pH值7.2），購自英濰捷基公司。

儀器：高壓均質(zhì)機（JN-Mini，廣州聚能納米公司）、酶標儀（Infinite200，TECAN）、離心機（CR21，Hitachi）、搖床（Ks4000，IKA）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌液的培養(yǎng)和收集 重組基因的E. coli DH5α工程菌采用兩步法培養(yǎng)，取3 μL重組工程菌液接種到3 mL新鮮LB培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素） 中，于37? ℃、220 r/min過夜培養(yǎng)15 h獲得種子液。隨后將種子也按照1%比例接種到新鮮LB培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素）中，37 ℃、220 r/min 繼續(xù)培養(yǎng)至D600 nm達到0.6左右，加誘導劑后繼續(xù)16 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)15 h。每 100 mL 誘導后的菌液于10 000 r/min 離心5 min，收集菌體，加入預(yù)冷的PBS緩沖液（pH值7.2） 50 mL 洗滌1次，然后加入預(yù)冷的PBS緩沖液 15 mL，充分懸浮，懸浮液置于-4 ℃待用。

1.2.2 菌液濃度測定 當菌液在600 nm時的吸光度值D600 nm小于0.7時，D600 nm與菌液濃度呈線性關(guān)系[11]，可用來監(jiān)測菌體生長情況，濃縮之后的菌液濃度用每升菌液中菌體濕質(zhì)量（g/L）表示。

1.2.3 蛋白質(zhì)濃度標準曲線的繪制 破碎之后上清液中可溶性蛋白的濃度用Bradford染色法測得[12]。將蛋白標準溶液分別稀釋成1.500、1.000、0.750、0.500、0.250、0.125 mg/mL的濃度梯度，然后分別取5 μL不同濃度的蛋白標準溶液到96孔酶標板，每個孔各加250 μL的G250染色液，反應(yīng) 5 min 后，用酶標儀測定595 nm處的吸光度，重復3次，得到標準曲線的方程為y=0.632 9x+0.532 5，相關(guān)系數(shù)r2=0.992 3，表明標準曲線相關(guān)性很好，可用于檢測樣品的蛋白質(zhì)濃度。

1.2.4 蛋白破碎率的測定 用上清液中可溶性蛋白的濃度與菌體濃度的比值表示蛋白破碎率。

1.2.5 單因素試驗設(shè)計 根據(jù)已有研究[7]，選取高壓均質(zhì)過程中關(guān)鍵影響因素均質(zhì)壓力、均質(zhì)次數(shù)、菌液濃度，設(shè)計單因素試驗，研究每個因素對破碎結(jié)果的影響，試驗方案如下：（1）在菌液濃度為100 g/L，均質(zhì)次數(shù)為3次時，分別用80、100、120、140、160 MPa均質(zhì)壓力破碎菌液，分析均質(zhì)壓力對大腸桿菌破碎結(jié)果的影響。（2）在均質(zhì)壓力為 120 MPa，菌液濃度為100 g/L時，分別均質(zhì)1、2、3、4、5次，分析均質(zhì)次數(shù)對大腸桿菌破碎結(jié)果的影響。（3）在均質(zhì)壓力為120 MPa，均質(zhì)次數(shù)為3次時，分別用60、80、100、120、140 g/L濃度的菌液進行破碎，分析菌液濃度對大腸桿菌破碎結(jié)果的影響。

1.2.6 響應(yīng)面試驗設(shè)計 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，利用Design Expert V8.0.6軟件中Box-Behnken試驗設(shè)計方法，以均質(zhì)壓力（A）、均質(zhì)次數(shù)（B）、菌液濃度（C）為試驗因素，以蛋白破碎率為響應(yīng)值設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面試驗，并用方程對結(jié)果進行擬合及優(yōu)化，各因素及水平見表1所示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗每個試驗點做3次重復，使用Excel 2016處理數(shù)據(jù)及制作圖表。響應(yīng)面結(jié)果用Design Expert V8.0.6進行擬合，方差分析并優(yōu)化參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果分析

2.1.1 不同均質(zhì)壓力對破碎結(jié)果的影響 由圖1可知，在均質(zhì)壓力達到120 MPa之前，隨著壓力的增大，大腸桿菌蛋白破碎率明顯升高，100 MPa和 120 MPa 處理之間差異達到顯著水平（P<0.05）。當均質(zhì)壓力達到120 MPa之后，隨著均質(zhì)壓力上升，大腸桿菌蛋白破碎率緩慢升高，但是處理之間差異不顯著，說明壓力達到120 MPa時，樣品的破碎已經(jīng)接近完成，升高壓力對結(jié)果的影響已經(jīng)不明顯，因此，選用的均質(zhì)壓力為120 MPa。

2.1.2 不同均質(zhì)次數(shù)對破碎結(jié)果的影響 由圖2可知，樣品破碎前期（次數(shù)≤3）增加均質(zhì)次數(shù)可以顯著提高大腸桿菌蛋白破碎率，處理之間差異達到顯著水平（P<0.05）。但是均質(zhì)3次之后，繼續(xù)增加均質(zhì)次數(shù)，結(jié)果的增加幅度明顯放緩，均質(zhì)3、4和5次處理之間差異均不顯著。過長時間的破碎有可能導致釋放出的蛋白質(zhì)降解，并且考慮時間成本，選擇的均質(zhì)次數(shù)為3次。

2.1.3 不同菌液濃度對破碎結(jié)果的影響 由圖3可知，隨著菌液濃度的提高，大腸桿菌的蛋白破碎率呈緩慢下降的趨勢，但各處理的結(jié)果基本維持在較高的水平（>9.5%），除了濃度最低的60 g/L處理，其他處理之間差異都不顯著，說明菌液濃度對大腸桿菌蛋白破碎率的影響較小。因此，選取差異不顯著的第1個處理，也就是80 g/L作為后續(xù)試驗條件。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

根據(jù)試驗設(shè)計，一共安排響應(yīng)面試驗15組，試驗順序及結(jié)果如表2所示。通過軟件對結(jié)果進行二元多次回歸擬合，得到蛋白破碎率的回歸方程為Y=11.55+0.82A+1.5B+0.18C-0.38AB-0.59AC+0.055BC+0.25A2-0.12B2+0.062C2。該回歸方程模型的P模型=0.000 8<0.01，表明模型極顯著;失擬項p失擬=0.155 4>0.05，表明模型失擬項不顯著;模型的確定系數(shù)R2=0.9820，調(diào)整確定系數(shù)R2adj=0.949 5，說明該模型能解釋94.95%的響應(yīng)值變化，因此，該模型擬合良好，可以用此模型對最優(yōu)破碎參數(shù)進行分析和預(yù)測。

從表3可知，一次項A、B達到極顯著水平（P<0.01），而C不顯著，表明均質(zhì)壓力和均質(zhì)次數(shù)對蛋白破碎率影響極大，菌液濃度對蛋白破碎率的影響相對不顯著。二次項中除了AC因素之間交互作用顯著外，其他因素之間交互作用都不顯著，表明因素之間的交互作用對蛋白破碎率的影響較小。而且各因素對大腸桿菌蛋白破碎率影響大小順序為均質(zhì)次數(shù)（B）>均質(zhì)壓力（A）>菌液濃度（C）。

通過觀察兩因素之間的響應(yīng)曲面圖可以預(yù)測變量的響應(yīng)值以及確定變量之間的相互關(guān)系，響應(yīng)面越陡，反映兩因素之間的交互作用越顯著[13]。三因素兩兩之間的響應(yīng)面曲面見圖4，可見圖4-a的響應(yīng)曲面較陡，表明均質(zhì)壓力和均質(zhì)次數(shù)之間交互作用較顯著，對蛋白破碎率的影響較大。圖4-b、圖4-c的響應(yīng)曲面較平緩，表明均質(zhì)壓力與菌液濃度、均質(zhì)次數(shù)與菌液濃度之間的交互作用較不顯著，對響應(yīng)值的影響較小。

2.3 最優(yōu)參數(shù)的確定及驗證

在選取的因素范圍內(nèi)，通過DesignExpert V8.0.6軟件提取的最優(yōu)條件：均質(zhì)壓力140 MPa、均質(zhì)次數(shù)4次、菌液濃度60 g/L，在此條件下，回歸模型預(yù)測的理論蛋白破碎率為14.04%。為了驗證預(yù)測結(jié)果的可靠性，根據(jù)預(yù)測試驗條件，經(jīng)過3次重復，得到大腸桿菌實際蛋白破碎率為13.98%，這與預(yù)測值非常接近。說明該模型能較好地擬合實際情況，有一定的實踐指導意義。

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗，分析了均質(zhì)壓力、均質(zhì)次數(shù)和菌液濃度3個因素對大腸桿菌蛋白破碎率的影響。然后根據(jù)單因素試驗結(jié)果，利用響應(yīng)面試驗擬合出大腸桿菌蛋白破碎率的二元多次回歸方程，各因素對大腸桿菌蛋白破碎率影響順序為均質(zhì)次數(shù)（B）>均質(zhì)壓力（A）>菌液濃度（C），并確定最優(yōu)化的試驗參數(shù)：均質(zhì)壓力140 MPa、均質(zhì)次數(shù)4次、菌液濃度60 g/L，在此條件下的大腸桿菌實際蛋白破碎率為13.98%。該結(jié)果可為高壓均質(zhì)法破碎大腸桿菌，提取胞內(nèi)外源蛋白提供一定的方法借鑒，并適用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。

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