高代轉玉米C4-pepc基因水稻株系形態和產量特性及其聚類分析

王凈 周興雅 張金飛 曹悅 吳博晗 李霞

摘要：為獲得高光效的轉C4型PEPC（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC，EC.1.1.31）基因水稻（簡稱PC）高代的穩定株系，選取2019—2020年種植的同一株系的PC材料，分析PC材料的形態、光合參數、酶活性以及產量構成因子等的變化特點，并將各參數進行聚類分析。結果表明，PC高代材料的PEPC酶活性、凈光合速率以及產量構成因子等指標的確存在年度間和株系間的變化，其中變異系數表現為產量構成因子<凈光合速率

關鍵詞：水稻;PEPC酶;凈光合速率;產量因子;聚類分析

中圖分類號： S511.01? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）17-0091-05

收稿日期：2020-12-17

基金項目：國家自然科學基金（編號：31571585）;江蘇省重點研發計劃（編號：BE2019377）;國家重點研發計劃（編號：2016YFD0300501-03）。

作者簡介：王 凈（1994—），女，河南周口人，碩士研究生，主要從事水稻作物生理研究。E-mail：1790438668@qq.com。

通信作者：李 霞，博士，研究員，主要從事水稻逆境生理研究。E-mail：jspplx@jaas.ac.cn。

水稻（Oryza sativa L.）是全球一半以上人口的主食，其超高產量品種和栽培技術的發展都建立在株型改良的基礎上[1]。利用數量性狀（quantitative trait locus，QTL）分析發現，株高主要受頂部1節間和頂部4節間長度的影響[2]。在保證抗倒性和保持收獲指數不變的前提下，株高的增加可提高生物量和最終產量[3]。水稻高光效機制是水稻超高產育種的重要理論基礎，其中單個C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC，EC.1.1.31）轉基因水稻（簡稱PC）具高光效特性，受到作物科學工作者的廣泛關注[4]。

高表達轉C4型PEPC水稻在高光強和高溫條件下，外源導入的C4-pepc表達和PEPC酶活性均顯著增加，而且功能葉片的光合效率也顯著提高[5]，單株產量比未轉基因的野生型原種Kitaake（簡稱WT）也顯著提高[6]，并將水稻開花后5～10 d劍葉的PEPC酶活性作為水稻高光效育種篩選的可靠生理指標[4]。分子機制研究發現，PEPC酶活性增強和C4-pepc表達上調與NO和Ca2+參與蛋白激酶和轉錄因子的介導密切相關[7]。在干旱脅迫下，PC水稻中C4-pepc的調節與其糖信號-蔗糖非發酵蛋白激酶（sucrose nonfermenting-1-related protein kinase，SnRKs）家族的調節有關，如亞家族 1-SnRK1 相關基因OsK1a、OsK24、OsK35的表達和SnRK2均高于WT[8]。而外源葡萄糖施入試驗表明，SnRK3s家族基因可與鈣調B類磷酸酶（calcineurin-B-like，CBL）作用誘導NO 參與PC葉片氣孔調節，從而有利于PC 耐旱[9]。因此，PC作為水稻干旱耐性機制研究材料而被關注。但隨著這10余年的研究以及多代繁殖，觀察到高代轉C4-pepc水稻株系的酶活性表達不穩定，且呈下降趨勢，導致相應的轉基因材料耐旱優勢也受限。因此，如何使外源導入的有益基因在水稻內穩定表達，是有益基因能否為水稻育種工作者利用的前提。前期的研究已觀察到不同的測定條件和不同的生育期是影響高代轉C4-pepc水稻株系酶活性發揮的重要因子[4-5]，但是高代PC 株系在相同條件下仍然存在酶活性的差異，這在一定程度上影響了該材料耐性生理機制的深入研究和材料在育種中的應用。因此，本研究選取不同年份同一株系的高代PC材料，研究年度間高代PC材料形態、光合參數、酶活性以及產量構成因子的變化特點，并將各參數進行聚類分析，以確定穩定的篩選指標，用于高代高光效水稻材料的利用。期望該研究可為篩選高效穩定的高光效水稻材料提供參考，也可為今后解析其高光效差異的內在機制提供新視角。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選取的PC高代材料最初由美國華盛頓州立大學古森本教授贈送，該材料是通過農桿菌介導獲得高表達轉玉米C4-pepc全基因的第3代水稻株系，獲得的水稻種子每年都在江蘇省農業科學院轉基因作物基地種植。在本研究中，選取2018—2019年種植的高代材料31個株系，每個株系都是上一年收集的單穗種子于次年種植獲得的植株。水稻種子分別于2019年、2020年的5月1日播種，在水泥池種植，每穴播1苗，每個單穗種植的材料作為1個株系，并編號、掛牌，常規水肥和病蟲草害管理，于7月底在植株開花后7～14 d，測定劍葉的光合參數，同步取樣，液氮保存，用于測定葉片的酶活性，成熟后單株收獲。

1.2 光合參數測定

參照王超等的方法[5]，使用美國LI-COR公司生產的LI-6400便攜式光合測定儀，開放式系統紅藍光源測定。晴天的08：30—11：30，室外溫度25～30 ℃，相對濕度70%～80%，測定水稻株系劍葉的凈光合速率（net photosynthetic rate，Pn），室外進行，每個處理5～6次重復。

1.3 形態指標的測定

在開花后50 d收獲植株，每個株系在收獲時選取5株測定其形態指標，包括株高、有效分蘗數和穗長等。

1.4 葉片磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）活性的測定

參照 Giglioli等的方法[10]測定PEPC的活性。簡單來說將0.1 g水稻劍葉置于提前冷凍的研缽中研磨，加入1 mL粗酶提取緩沖液，在4 ℃下? 13 000 g 離心10 min，收集上清液（即粗酶液）。在酶活性測定的反應體系（1 mL）中依次加入725 μL混合液，25 μL 5 mmol/L 磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruate，PEP），150 μL粗酶液搖勻后，用紫外分光光度計（UV-1200型，上海美譜達儀器有限公司），記錄340 nm處吸光度的變化，計算酶活性。

1.5 產量構成因子測定

在開花后40 d，每個株系選3株長勢一致的供試材料單株收獲，自然晾曬至籽粒含水量小于14%時，在室內進行考種，并測定其產量構成因子。

1.6 數據處理

使用SPSS 22.0軟件對數據進行統計以及聚類分析，采用Microsoft excel 2016軟件對數據進行描述和作圖。

2 結果與分析

2.1 高代PC株系劍葉PEPC酶活性的變化及其聚類分析

水稻生育后期劍葉的PEPC酶活性為水稻高光效特性的重要篩選指標[4]。因此，本研究選取了高代PC 株系共31株，連續2年選取水稻株系的劍葉測定其PEPC酶活性，所有株系PEPC 酶活性為（1 723.72±1 139.14） nmol/（min·g），變異系數為0.66。并使用WARD 法對PEPC酶活性數據進行聚類分析 （度量標準為Euclidean 距離），以閾值 20 作為聚類標準，可將供試材料的類型量化細分為3類（表1）。其中類型Ⅰ為高PEPC酶活性類型，PEPC酶活性為4 982.70 nmol/（min·g），包括第2、22株系，占供試材料的 6.45%;類型Ⅱ為低PEPC酶活性類型，PEPC酶活性為 841.98 nmol/（min·g），包括第13、14、16、17、19、20、24、26、27、28、31株系，占供試材料的35.48%;類型Ⅲ 為PEPC酶活性位于中間的材料類型，PEPC酶活性為1 900.44 nmol/（min·g），包括第1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、18、21、23、25、29、30株系，占供試材料的58.06%。可見，高代PC的PEPC酶活性的確存在一定的變異。

2.2 高代PC株系劍葉凈光合速率的變化及其聚類分析

連續2年同步測定對應株系抽穗期，開花后 14 d 劍葉的凈光合速率（photosyntheticrate，Pn），2年所有株系的平均值和標準差為（17.11±4.14） μmol/（m2·s），變異系數為0.24，將該參數經過WARD法聚類分析（度量標準為Euclidean距離），以閾值8作為聚類標準，也可將供試材料的類型量化細分為3類。其中類型Ⅰ為高凈光合速率類型，包括第1、2、3、7、22、23株系，占供試材料的19.35%，凈光合速率平均值為 21.53 μmol/（m2·s）;類型Ⅱ為低凈光合速率類型，包括第15、20、21、29、30株系，占供試材料的16.13%，凈光合速率的平均值為 14.65 μmol/（m2·s）;類型Ⅲ為凈光合速率位于中間的材料類型，包括第4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、16、17、18、19、24、25、26、27、28、31株系，占供試材料的64.52%，凈光合速率為 16.40 μmol/（m2·s），和酶活性的表現一樣也呈現正態分布（表2）。

2.3 高代PC株系產量構成因子的變化及其聚類分析

連續2年在同期同步記錄了不同株系產量構成因子的變化，其中2年的平均值分別為株高為（75.38±3.64） cm，變異系數為0.05;總分蘗數為（9.85±1.84）個，變異系數為0.19;有效分蘗數為（7.64±1.56）個，變異系數為0.20;千粒質量為（21.88±0.58）g，變異系數為0.03;穗長為（10.49±0.65） cm，變異系數為0.06;穗粒數為（28.32±4.05）個，變異系數為0.14;結實率為（72.21±6.85）%，變異系數為0.09;單株產量為（3.56±1.19） g，變異系數為0.33。可見，供試材料各形態指標變異小于其單株產量，單株產量的變化主要與有效穗數和每穗粒數的變化密切相關。進一步將這些數據經過WARD法聚類分析（度量標準為Euclidean距離），以閾值12作為聚類標準，也可將供試材料的類型量化細分為3類。其中類型Ⅰ為高產類型，包括第4、5、7、13、16、17、21、22、30株系，占供試材料的29.03%;類型Ⅱ為低產類型，包括第2、6、12、20、23、25、26、27、28、31株系，占供試材料的32.26%;類型Ⅲ為產量位于中間的材料類型，包括第1、3、8、9、10、11、14、15、18、19、24、29株系，占供試材料的38.71%（表3）。

2.4 PEPC酶活性、凈光合速率和產量指標的聚類分析

進一步將本研究中PC高代材料測定的3類指標數據也經過WARD法聚類分析（度量標準為Euclidean距離），以閾值15作為聚類標準，可將供試材料的類型量化細分為3類（表4）。其中類型Ⅰ為高PEPC酶活性，高凈光合速率和中產的材料類型，包括第1、2、3、7、22、23株系，占供試材料的19.35%;類型Ⅱ為低PEPC酶活性，低凈光合速率和高產的材料類型，包括第13、14、16、17、19、20、24、26、27、28、31株系，占供試材料的35.48%;類型Ⅲ為中等光合能力的材料類型，包括第4、5、6、8、9、10、11、12、15、18、21、25、29、30株系，占供試材料的45.16%。從圖1可以看出，類型Ⅰ實際上還可以細分為2個小的亞型，Ⅰ-1包括1、3、7、23共4個株系，占供試材料的12.90%，這類型的PEPC活性[平均值2 747.19 nmol/（min· g）]和凈光合速率[平均值為21.49 μmol/（m2·s）]仍高于其他2個大類型（Ⅱ和Ⅲ），而且單株產量最高（平均值為4.18 g/株）;而Ⅰ-2，只包括2個株系（2和22），占比6.45%，這類型的PEPC酶活性最高[平均值 4 982.70 nmol/（min· g）]，凈光合速率與Ⅰ-2的類似，也較高[平均值為 21.60 μmol/（m2·s）]，但是產量則最低（平均值為2.87 g/株）。進一步從各類參數的相關性分析可知，PC株系的Pn與PEPC酶活性的相關系數為0.808，呈極顯著相關（P<0.01），PEPC酶活性的發揮與光合能力密切相關，但是與單株產量相關性不顯著。

3 討論與結論

C4植物與C3植物的一個重要區別是C4植物的CO2補償點很低，所以C4植物在CO2含量低的情況下存活率更高，而且C4植物在高光強、高溫和干旱等條件下，比C3植物具有較高的CO2固定效率、水分利用率和籽粒產量[11]，其中C4植物光合作用的關鍵酶PEPC起關鍵作用。科學家已經通過基因工程，將該基因引入C3植物如水稻中，該基因不僅在水稻中獲得高表達，而且表現高光效，并最終表現出籽粒產量提高[12-13]。與原種Kitaake相比，高表達轉玉米pepc基因水稻（PC）不僅表現出較強的光合能力和較高的籽粒產量，而且還在強光、高溫、干旱和低氮下均具有較高的凈光合速率和籽粒產量，并與高PEPC酶活性的誘導密切相關[8，14-18]，可以作為研究植物耐逆機制的有益資源。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶在 C4植物中起濃縮 CO2以提高光合效率的作用。王強等研究表明，兩優培九超高產的重要原因，與其較高的光能和CO2利用效率、較強的抗光抑制能力以及較高的 C4途徑酶PEPC的表達水平相關[19]。研究表明，PEPC酶在不同生育期、不同部位以及不同光強條件下的表達特征曲線與光合速率具有密切關系，特別在產量形成的關鍵時期，外源PEPC基因高水平表達與凈光合速率的高值出現期表現一致，而且相對穩定，此時測定的劍葉PEPC活性可作為水稻高光合速率的可靠分子育種指標，這為水稻高光效特性鑒定和篩選提供了依據，并能為作物高光效機制的研究提供有用的材料[4]。本研究利用相關的篩選指標，檢測了年度間高代的31株系PC水稻的高光效特性和產量表現。結果表明，PC的高代材料在PEPC酶活性的發揮、凈光合速率以及產量構成因子等指標上的確存在年度間和株系間的變化，其中變異系數產量構成因子<凈光合速率

磷酸烯醇丙酮酸羧化酶包括植物型PEPC（plant-type phosphoenolpyruvate carboxylase，PTPC）和細菌型PEPC（bacterial-type phosphoenolpyruvate carboxylase，BTPC）等多基因家族。BTPC和PTPC相互作用，形成2類異性寡聚多肽復合物[20]，在蓖麻（Ricinus communis）種子發育中發揮重要作用。因此，它的功能很多樣，而且PEPC酶和基因的調節也很復雜。前期研究表明，與WT相比，PC材料在高光強[14]、高溫[15]、干旱[7]以及低氮條件[17]下均表現出較好的耐性，而且這些優異的特性與PEPC酶活性的發揮以及C4-pepc基因的調節密切相關。信號分子H2O2[6]、NO[21]、Ca2+[7]、磷脂酸[22]、 ATP[23] 以及糖分子[24-25]均參與其基因的表達。本研究還觀察到PC水稻在響應干旱逆境時C4-pepc有去甲基化現象發生，有利于C4-pepc的高表達，也伴隨著PEPC的磷酸化以及相關基因的表達，顯示了表觀遺傳機制可能也參與該材料干旱的響應機制[8]。因此，深入研究PC不同株系PEPC酶活性的調節機制，是獲得穩定高光效材料的重要理論基礎，將有助于揭示其基因表達差異的內在原因。

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