自組裝納米多肽水凝膠負載干細胞對軟骨損傷修復的研究

曾統(tǒng) 唐碩 張迪 鄒峰 鄒學農 陳海堡 靳松

【關鍵詞】絲蛋白降解;骨髓間充質干細胞;軟骨分化;水凝膠;自組裝

骨性關節(jié)炎的發(fā)病率隨著人口老齡化程度的增加明顯增高，已經成為嚴重影響身體健康的疾病之一，其主要病理特點是關節(jié)軟骨的破壞與缺損，因此關節(jié)軟骨修復是骨性關節(jié)炎的治療關鍵。骨髓間充質干細胞（BMSC）是一類來源于骨髓的具有多向分化潛能的干細胞，具有自我更新、組織再生和抗炎修復等功能[1]。研究表明BMSC在特定誘導條件下可以轉化成軟骨細胞，進而促進關節(jié)軟骨損傷的修復[2]。BMSC來源廣泛，體外培養(yǎng)可誘導類軟骨細胞分化，是一種非常有前景的可應用于臨床治療軟骨缺損修復的種子細胞[3]。自組裝多肽納米纖維水凝膠通過簡單調節(jié)分子間電荷作用和氫鍵之間的平衡，使兩親性多肽聚集成了不同形態(tài)的組裝體進而得到了具有等級結構的宏觀多肽材料[4]。前期實驗證明自組裝多肽形成的水凝膠支架能夠為細胞培養(yǎng)提供良好條件[5]。本研究將新西蘭兔的BMSC接種至加載納米質粒骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（pBMP2）及環(huán)狀精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽（cRGDfK）功能性多肽支架上培養(yǎng)，研究自組裝多肽形成的納米級結構特征及BMSC在支架材料上的生長狀態(tài)、生物相容性、向軟骨細胞分化情況及軟骨修復效果，為其進一步作為骨組織工程支架的體內研究提供實驗依據(jù)。

材料與方法

一、實驗動物

新西蘭大白兔20只，雌性，兔齡（11.01±1.03）月，體質量（5.12±1.21）kg，購自中山大學實驗動物中心，本動物實驗方案經中山大學動物實驗倫理委員會批準（批件號2020d022），所有操作均符合實驗動物倫理要求。

二、主要材料和儀器

10%胎牛血清購自美國HyClone公司;高糖型DMEM培養(yǎng)基、谷氨酰胺購自美國Gibco公司;胰酶、0.02%乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、青霉素鏈霉素雙抗、β-甘油磷酸鈉、地塞米松和CCK-8檢測試劑盒購自美國Sigma公司;逆轉錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒和TRIzolRNA抽提試劑購自美國Invitrogen公司，鈣黃綠素-AM（Calcein-AM）和碘化丙啶（PI）活細胞/死細胞雙染試劑盒購自中國尚寶生物。主要儀器包括低速離心機（Thermo，德國）、倒置顯微鏡（Olympus，日本）、超聲波清洗機（科凈達，中國）、原子力顯微鏡（AsylumResearch，美國），激光共聚焦熒光顯微鏡（Nikon，日本），酶標儀（VarioskanFlash，美國）、實時PCR儀（Bio-Rad，美國）、安捷倫1100高效液相色譜（HPLC）儀（Agilent，美國）、質譜儀（FinniganLCQ，美國）、冷凍干燥機（Labconco，美國）。

三、方法

1.多肽自組裝水凝膠支架的制備和檢測

設計2條攜帶pBMP2及cRGDfK軟骨細胞特異性黏附肽的兩親性多肽，分別為PA1（C12AAADDD-GAGAGAGY）和PA2（C12AAADDD-cRGDfK），委托上海波泰公司用固相自動多肽合成儀合成;采用HPLC儀純化并檢測其純度;質譜儀檢測其平均分子量。根據(jù)文獻[6]在無菌條件下取10mg兩親性多肽粉末溶于400μl0.1mol/L氫氧化鈉溶液中;充分振蕩混勻溶解，然后在37℃培養(yǎng)箱中溫育1h，直到粉末完全溶解。然后再繼續(xù)添加無菌的雙蒸水至多肽溶液總體積為1ml，此時自組裝多肽臨界點為1%，多肽溶液呈黏稠狀，放置4℃冰箱保存。凝膠纖維的制備是直接將pH8的多肽溶液用1ml的注射器注射至0.1mol/L的鹽酸溶液中，即得到白色的凝膠狀纖維，利用掃描電鏡檢測支架結構，使用原子力顯微鏡觀察自組裝納米多肽的纖維結構形態(tài)。

2.BMSC的分離和培養(yǎng)鑒定

將兔固定后消毒鋪巾，利多卡因20ml局部麻醉，利用骨穿穿刺針采集新鮮骨髓，按1∶3體積比加入10%胎牛血清、100kU/L青霉素的DMEM細胞培養(yǎng)液，充分混勻后移入25ml的Hank培養(yǎng)瓶中差速貼壁法培養(yǎng)，3d后棄培養(yǎng)瓶中的油脂等雜質，然后每3d換1次細胞培養(yǎng)液。待BMSC細胞融合率達70%～80%后進行傳代培養(yǎng)。采用流式細胞儀檢測BMSC表面蛋白CD34、CD45、CD90和CD105的表達[7]。

3.多肽自組裝水凝膠與BMSC共培養(yǎng)

生物相容性檢測（活細胞/死細胞雙重染色）：配制DMEM/F12培養(yǎng)液，濾膜過濾滅菌混合后渦旋5s，加入BMSC混勻，調整濃度為2×106/ml細胞懸液，接種于有多肽自組裝水凝膠的24孔板中，每孔100μl，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)72h后，采用Calcein-AM/PI試劑進行染色，在熒光顯微鏡下觀察活細胞（黃綠色熒光）以及死細胞（紅色熒光）并且拍照記錄，其中活細胞顯示出黃綠色熒光，死細胞顯示出紅色熒光[7]。

使用CCK-8法檢測水凝膠上BMSC的增殖情況：在96孔培養(yǎng)板分別滴加50μl工作液，成膠后分別在空白孔、多肽自組裝水凝膠上滴加100μl3×104/ml的第2代BMSC細胞懸液。分為BMSC組、水凝膠組和BMSC復合水凝膠組，在培養(yǎng)6h、12h、1d、2d、3d、7d時，每組中各取1個孔加入1μlCCK-8溶液，37℃孵育1h，酶標儀檢測450nm吸光度;使用GraphPadPrism7.0軟件繪制生長曲線圖。

水凝膠對BMSC成軟骨分化的影響：實時定量PCR檢測蛋白聚糖（AGN）、Ⅱ型膠原a1（COL2a1）、成軟骨分化調控基因Sox-9mRNA在不同時間點（1、2、3、4周）的表達。在96孔細胞培養(yǎng)板中設置空白組、誘導液（CM）組、水凝膠組、水凝膠與CM混合組，加入3×104/孔的第3代BMSC。分化培養(yǎng)1、2、3、4周后，吸盡孔內液體，用磷酸鹽緩沖液清洗3次，每孔加入100μl細胞裂解液并反復吹打。鏡下觀察已無完整細胞結構，按檢測試劑盒說明書檢測。結果以Ct值表示，β-actin為內參照，以2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量[8]。引物序列見表1。

4.體外軟骨缺損修復實驗

建立雙側膝髕股關節(jié)股骨髁部淺表層軟骨缺損（軟骨全層厚度的25%）兔模型，分組植入凝膠。取20只成年健康新西蘭大白兔，隨機分4組，每組5只。正常組手術顯露關節(jié)后不造模，缺損對照組造模后不處理，水凝膠組造模后植入水凝膠支架，水凝膠載荷干細胞組在造模后植入水凝膠支架和BMSC復合物。造模：用水合氯醛靜脈麻醉后，常規(guī)消毒鋪無菌單，取膝關節(jié)正中側切口，逐層切開皮膚、皮下軟組織、淺深筋膜，顯露膝關節(jié)股骨側，使用口腔鉆在其軟骨層進行鉆孔，形成長2.5mm、寬1.0mm、深1.5mm的錐形軟骨缺損，生理鹽水沖洗，進行相應干預后逐層縫合。3個月后將實驗動物處死，取軟骨缺損組織行甲苯胺藍染色，應用國際軟骨修復協(xié)會（ICRS）評分系統(tǒng)評估染色結果，評分越高代表修復效果越好[8]。

四、統(tǒng)計學處理

采用SPSS20.0處理數(shù)據(jù)，正態(tài)分布的計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義

結果

一、自組裝水凝膠的鑒定與觀察

兩親性多肽設計及合成的檢測：設計含pBMP2及cRGDfK功能性多肽自組裝水凝膠，用固相自動多肽合成儀合成;采用HPLC分析目標多肽出現(xiàn)3個峰值，見圖1A。在PeakNo.3時，RetTime為19左右，面積（Area）最大，出現(xiàn)多肽洗脫最高峰，此時多肽純度（Conc.）為96.70%;純化后收集目標肽，然后冷凍干燥后行質譜儀檢測其平均分子量為3219，證實了與理論分子量設計是一致的，見圖1B。其目標肽RGDK-＼IKVAVAK-/KGGGGAAAAK-C16H31O化學結構可見pBMP2序列及cRGDfK序列2個肽鏈分支結構，見圖1C。水凝膠形成后，原子力顯微鏡下觀察顯示支架表面粗糙、凹凸不平，有利于細胞黏附和遷移，見圖1D、E。

二、BMSC的培養(yǎng)和鑒定

原代BMSC培養(yǎng)48h后開始貼壁，細胞呈梭形或者多角形;培養(yǎng)至第2代后，細胞呈旋渦狀或者輻射狀生長，增殖迅速。取第3代生長狀態(tài)良好BMSC，流式細胞儀檢測CD34-FITC和CD90-PE、CD45-FITC和CD105-PE單克隆抗體，以同型非特異性IgG-PE、IgG-FITC作陰性對照，CD90陽性和CD34陰性的比例為95.10%，CD105陽性和CD45陰性的比例為91.22%，即CD90和CD105高度表達，而CD34和CD45未能表達或表達極低水平，符合BMSC表面抗原表達，見圖2。

三、水凝膠與BMSC的生物相容性及其對BMSC增殖及成軟骨分化的影響

培養(yǎng)72h后，熒光顯微鏡下觀察兔BMSC在自組裝水凝膠中生長狀態(tài)穩(wěn)定，形態(tài)良好，輪廓清晰，分布均勻。細胞染色示以綠染的活細胞為主，只有極少數(shù)紅染的死細胞，見圖3A。CCK-8檢測細胞增殖結果顯示，BMSC復合水凝膠組在培養(yǎng)3d時吸光度高于BMSC，比較差異有統(tǒng)計學意義（t=31.231，P<0.001），見圖3B。空白組、水凝膠、CM組和水凝膠與CM混合組的AGN、COL2a1、Sox-9mRNA表達在第2～4周比較差異均有統(tǒng)計學意義（FAGN=245.135，PAGN<0.001;FCOL2a1=57.254，PCOL2a1<0.001;FSox-9=247.154，PSox-9<0.001），其中有水凝膠的環(huán)境更有利于BMSC成軟骨分化，見圖3C。

四、兔軟骨缺損模型大體觀察及甲苯胺藍染色分析

兔關節(jié)軟骨缺損修復效果的大體觀察及甲苯胺藍染色分析顯示，水凝膠載荷干細胞修復最理想，缺損對照組軟骨缺損范圍大、炎癥細胞浸潤多，水凝膠組軟骨缺損范圍較缺損對照組明顯減少，水凝膠載荷干細胞組炎性細胞消失且和正常組形態(tài)基本相近。4組的ICRS評分比較差異有統(tǒng)計學意義（F=99.537，P<0.001），干細胞載荷水凝膠組評分高于水凝膠組（LSD-t=45.526、P<0.001）及缺損對照組（LSD-t=156.751，P<0.001），見圖4。

討論

自組裝納米多肽水凝膠支架材料是由多種氨基酸構成并且具有疏水性和親水性區(qū)域的一類纖維，有良好的生物相容性、可降解、無毒性及免疫原性等優(yōu)點[9]。水凝膠支架在啟動軟骨細胞分化、維持細胞的存活起著重要的作用已被廣泛報道[10]。有研究顯示，將水凝膠支架肽鏈延長，上載能促進間充質干細胞向軟骨細胞分化的TGF-β1短肽序列，可成功修復猴股骨髁軟骨缺損模型，這一嶄新的設計理念給軟骨仿生材料的研制帶來極大的啟示[11]。有學者曾利用絲素蛋白β折疊將神經生長因子（NGF）負載于支架上，NGF能緩慢釋放3個月以上[12]。

本研究設計含pBMP2及cRGDfK功能性多肽自組裝水凝膠，用固相自動多肽合成儀合成并且證實與理論分子量設計是一致。原子力顯微鏡觀察自組裝多肽可以形成納米纖維網(wǎng)狀結構并且提供腔隙。倒置顯微鏡觀察顯示BMSC的生長良好。目前尚未發(fā)現(xiàn)BMSC抗原特異性表型標記，根據(jù)文獻大致為陽性表達CD90、CD44、CD34、CD54、CD73、CD29、CD13、CD146、CD106和CD105，陰性表達CD34、CD31、CD45、CD49d、CD14、CD10和CD11b[12]。本研究取第3代BMSC行流式細胞儀檢測表面抗原標志物，結果表明CD90和CD105高度表達，而CD34和CD45未能表達或表達極低水平，與文獻報道相符[13]。

細胞與材料的生物相容性是細胞在材料表面遷移、增殖與分化的前提[14]。本研究的BMSC與水凝膠共培養(yǎng)的雙重染色顯示以綠染的活細胞為主，只有極少數(shù)紅染的死細胞，說明生物相容性良好。CCK-8法結果顯示，BMSC復合水凝膠組在培養(yǎng)3d時細胞增殖能力高于BMSC組，表明在特定的分化刺激培養(yǎng)條件下水凝膠支架有助BMSC向成軟骨細胞分化。水凝膠本身由溶液轉變?yōu)槟z形態(tài)后并不具備特定的形狀。在既往的研究中，水凝膠常用于腔隙型骨缺損的修復，本研究選擇兔軟骨缺損模型大體觀察及甲苯胺藍染色分析，結果顯示水凝膠有利于關節(jié)軟骨組織修復，并且自組裝水凝膠載荷干細胞對修復關節(jié)軟骨缺損效果更好。

綜上所述，BMSC負載于多肽自組裝水凝膠支架中可通過暴露于納米纖維表面的cRGDfK環(huán)肽特異性黏附和募集間質干細胞誘導成軟骨分化，從而有助修復關節(jié)軟骨缺損。這種新型多肽納米纖維水凝膠材料可為臨床上骨關節(jié)炎的軟骨損傷修復治療提供新的研究方向。