熱中性區臨界溫度對黑線倉鼠哺乳期能量收支的影響

王桂英， 曹靜， 趙志軍

(1. 聊城大學農學院，山東聊城252059； 2. 溫州大學生命與環境科學學院，浙江溫州325035)

能量代謝的生理適應性調節是小型哺乳動物應對環境溫度變化的最主要能量學策略之一，對提高生存適應能力具有重要意義(王德華，2011)。繁殖期是小型哺乳動物生活史的重要階段，哺乳期是繁殖過程中能量攝入和支出效率最高的時期，母體顯著增加攝食量以增加能量攝入，通過增加泌乳的能量支出以滿足后代生長發育，哺乳期能量收支通常達到最大的狀態(閾值)，即最大能量收支受到了限制(Speakman & Król，2011)。

對哺乳期最大能量收支的限制因素和機制已有很多研究，“熱耗散限制假說”認為哺乳期能量代謝率顯著增加，釋放“熱”也顯著增加，由于機體散熱能力存在一定的限制，這將導致體溫升高，暖溫環境下由于體溫與環境溫度的溫差減小，熱傳導降低，機體散熱能力減弱，母體必須抑制哺乳期最大能量攝入和泌乳支出以降低體溫異常升高的風險；而低溫下動物的熱傳導率增加，打破了散熱能力的限制，從而“準許”其提高能量攝入和代謝支出，從而使繁殖輸出增加(Speakman & Król，2011)。Król和Speakman(2003)比較了低溫(8 ℃)、室溫(21 ℃)和暖溫(30 ℃)下MF1小鼠Musmusculus的能量攝入和泌乳能量支出，發現與室溫組相比，暖溫組能量攝入和繁殖能量支出顯著降低，而低溫組顯著增加。暖溫(30 ℃)下哺育大胎仔數的布氏田鼠Lasiopodomysbrandtii繁殖輸出顯著低于室溫組(Wuetal.，2009)。這些研究結果均符合“熱耗散限制假說”的預測。與此相反，哺乳期暴露于暖溫(30 ℃)的黑線倉鼠Cricetulusbarabensis，攝入能量顯著降低，而繁殖輸出未出現顯著變化(Zhao，2011)。顯然，這些研究結果并不一致，“熱耗散限制假說”難以給出合理的解釋。

溫度是影響小型哺乳動物能量代謝的最主要環境因子之一。通常在一定溫度范圍內，動物代謝率可以維持在穩定的最低水平，此溫度范圍稱為熱中性區(thermal neutral zone，TNZ)(IUPS Thermal Commission，1987)。TNZ及其上、下臨界點具有種屬差異，也與動物生活史階段和環境有關，其中，黑線倉鼠的TNZ范圍較寬，即在較寬的溫度范圍內維持體溫和代謝率的穩定，也許是暖溫馴化的黑線倉鼠未出現“熱耗散限制”的原因之一(Zhaoetal.，2010a)，但遺憾的是，TNZ特征與“熱耗散限制”的內在聯系和機制尚不清楚。

黑線倉鼠是棲息于我國華北地區農田和草原的主要嚙齒動物之一，在自然環境下該鼠面臨溫度的季節性變化較大：夏季干燥炎熱，冬季寒冷(張知彬，王祖望，1998；Zhaoetal.，2010a；趙志軍等，2014)。黑線倉鼠可通過增加能量攝入和代謝產熱應對哺乳和低溫環境的雙重能量需求，其最大能量收支限制在5.0×基礎代謝率(basal metabolic rate，BMR)(趙志軍，2015)；其TNZ為25～32.5 ℃(Zhaoetal.，2014)。本研究將哺乳期黑線倉鼠分別暴露于TNZ上、下臨界點溫度，通過測定哺乳期體質量、能量收支、靜息代謝率(resting metabolic rate，RMR)、熱傳導率(C)，以及血清催乳素含量、褐色脂肪組織(brown adipose tissue，BAT)解偶聯蛋白1(uncoupling protein 1，UCP1)mRNA表達等的變化，研究TNZ不同臨界點溫度下哺乳期最大能量攝入、靜息代謝能量支出和繁殖輸出的差異，深入理解催乳素和BAT UCP1在哺乳期最大能量收支和代謝產熱中的調節作用。

1 材料方法

1.1 實驗動物

實驗用黑線倉鼠為野生個體的繁殖后代(溫州大學動物福利委員會，實驗動物使用許可證號：WZU-048)，動物用塑料盒(長29 cm×寬15 cm×高18 cm)飼養于聊城大學實驗動物人工氣候室，溫度為21 ℃±1 ℃，光照周期為12 h∶12 h，飼喂標準鼠飼料(北京科奧協力飼料有限公司)。動物自由取食和飲水，塑料盒中加鋸末作為巢材。取3.5～4.5月齡健康雌鼠30只(均為處女鼠)，單籠飼養，與年齡相近的雄鼠配對。將19只妊娠的雌鼠隔離飼養，在哺乳期第5天將母鼠及其幼體隨機分為2組：TNZ下臨界點溫度組(LP：25 ℃，n=10)和上臨界點溫度組(UP：32.5 ℃，n=9)，隨即分別暴露于相應的溫度，至斷乳(哺乳期第17天)。在此期間，每日測定體質量、攝食量、胎仔數和胎仔質量。

1.2 攝食量、攝入能、消化率和泌乳能量支出

攝食量以當日添加飼料塊質量扣除次日剩余量和飼養籠內殘渣量來計算。在哺乳期第13～14天以食物平衡法測定攝入能和消化率(宋志剛，王德華，2001；余靜欣等，2020)。收集食物殘渣、墊料和糞便置于恒溫干燥箱60 ℃烘至恒重，手工分離食物殘渣和糞便并稱量干重(精度0.001 g)。用氧彈熱量儀(Parr 1281，Parr Instrument，USA)測定烘干后食物和糞便的熱值。攝入能、消化能及消化率計算公式(Grodzinski & Wunder，1975；劉全生等，2010)：攝入能(kJ/d)=攝食量(g/d)×飼料干物質含量(%)×食物能值(kJ/d)、消化能(kJ/d)=攝入能-糞便質量(g/d)×糞能(kJ/g)、消化率(%)=攝入能/消化能×100%。幼體的生長發育和活動行為等能量支出全部來自母乳，根據幼體的能量支出計算母體的泌乳能量支出(Król & Speakman，2003；Zhaoetal.，2010b)。

1.3 RMR和熱傳導率

RMR以開放式呼吸代謝儀(Sable System，美國)測定，呼吸室氣體流速為650～750 mL·min-1，氣體經硅膠干燥后進入氧分析儀，氣體二次抽樣速率為150～175 mL·min-1，每10 s采集一次數據(STD-UI2，Sable System)，以標準數據分析軟件分析。RMR持續測定2.5 h，測定溫度為30 ℃±0.5 ℃(TNZ溫度;Zhaoetal.，2010a)，以5 min內連續穩定的最低耗氧速率的平均值作為RMR[mL O2/(g·h)]。C[mL O2/(g·h·℃)]=RMR[mL O2/(g·h)]/(Tb-Ta)(℃)計算，其中，Tb為體溫，Ta為環境溫度(戰新梅，王德華，2004)。

1.4 催乳素

RMR測定后，斷頸處死動物，迅速分離肩胛間BAT和下丘腦，稱重(精度0.001 g)后置于液氮中，轉移低溫冰箱(-80 ℃)備用。取血，自然凝集2 h后，離心(3 500 r·min-1)10 min，吸取血清，-80 ℃保存。用放射性免疫測定試劑盒測定血清催乳素含量(北京北方生物技術研究所)，批內和批間測定變異系數均小于10%。

1.5 實時熒光定量PCR分析

用TRIzol試劑(TaKaRa，China)提取BAT和下丘腦總RNA，以RNA為模板反轉錄合成cDNA，然后進行熒光定量PCR反應(Forrentrasse CH-6343 Rotkreuz, Switzerland)，反應體系組成：模板cDNA 2 μL，SYBR Premix EX Tag TM(2×)10 μL，上、下游引物各0.4 μL，用DEPC水配足20 μL體系，反應程序為95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，40個循環；72 ℃ 30 s。UCP1上游引物：5’-GGGACCATCACCACCCTGGCAAAAA-3’，下游引物：5’-GGCTTTCTGTTGTGGCTAT-3’；下丘腦神經肽Y(neuropeptide Y，NPY)上游引物：5’-ACCCTCGCTCTGTCCCTG-3’，下游引物：5’-AATCAGTGTCTCAGGGCTA-3’;刺鼠相關蛋白(agouti-related protein，AgRP)上游引物：5’-TGTTCCCAGAGTTCCCAGGTC-3’，下游引物：5’-ATTGAAGAAGCGGCAGTAGCAC-3’；以actin為參照：上游引物：5’-CGTAAAGACCTCTATGCCAA-3’，下游引物：5’-GCGCAAGTTAGGTTTTGTC-3’(Zhaoetal.，2014)。

1.6 統計分析

2 結果

2.1 TNZ臨界溫度對體質量和攝食量的影響

哺乳期第5天，LP組和UP組體質量相近，溫度的影響不顯著(t17=0.54，P>0.05)，但整個哺乳期體質量呈下降趨勢，組間差異未達到顯著水平(t17=1.51，P>0.05；圖1：A)。哺乳期第5天，攝食量組間差異不顯著(t17=0.13，P>0.05；圖1：B)，暴露于TNZ下臨界點溫度的顯著升高，而暴露于TNZ上臨界點溫度的變化趨勢不明顯，自哺乳期第6天后，UP組顯著低于LP組(t17=7.98，P<0.01)，第14天，UP組比LP組低36.2%(t17=3.47，P<0.01)。

2.2 TNZ臨界溫度對胎仔數和胎仔質量的影響

哺乳初期胎仔數組間差異不顯著，LP組和UP組哺育幼體的數量相近(第5天：t17=1.71，P>0.05)，整個哺乳期胎仔數未出現明顯變化，LP組和UP組胎仔數相近，組間差異不顯著(第6天：t17=1.03，P>0.05；第14天：t17=0.36，P>0.05；圖1：C)。哺乳期第5天，胎仔質量組間差異不顯著(t17=0.01，P>0.05)，暴露于TNZ下臨界點溫度的幼體顯著增長，但暴露于TNZ上臨界點溫度的增長趨勢變緩，自哺乳期第12天后，UP組顯著低于LP組(第12天：t17=2.66，P<0.05；第14天：t17=3.31，P<0.05；圖1：D)。

2.3 TNZ臨界溫度對攝入能和消化率的影響

溫度對哺乳高峰期攝入能的影響顯著，UP組比LP組低36.2%(t17=3.51，P<0.01；圖2：A)。糞能也受溫度的顯著影響，UP組表現出較低的糞能(t17=3.15，P<0.01；圖2：B)。與攝入能的變化相似，消化能的組間差異顯著，UP組顯著低于LP組(t17=3.42，P<0.01；圖2：C)。但消化率未受到溫度的顯著影響(t17=0.37，P>0.05；圖2：D)。

2.4 TNZ臨界溫度對泌乳能量支出和熱傳導率的影響

溫度對泌乳能量支出的影響顯著，與LP組相比,UP組降低了25.1%(t17=3.33，P<0.01；圖2：E)。RMR也受溫度的顯著影響，UP組顯著低于LP組(t17=3.60，P<0.01；圖2：F)。熱傳導率組間差異達到顯著水平，UP組顯著低于LP組，受溫度的影響顯著(t17=3.54，P<0.01；圖2：G)。

2.5 TNZ臨界溫度對催乳素含量、BAT UCP1和下丘腦NPY mRNA表達的影響

LP組和UP組血清催乳素水平相近，組間差異不顯著，未受溫度的顯著影響(t17=0.86，P>0.05；圖2：H)。BAT UCP1mRNA表達受溫度的顯著影響，UP組比LP組下調了42.9%(t17=2.14，P<0.05；圖3：A)。溫度對下丘腦NPY和AgRp mRNA表達的影響未達到顯著水平(NPY：t17=1.17，P>0.05，圖3：B；AgRp：t17=0.05，P>0.05，圖3：C)。

3 討論

哺乳期是小型哺乳動物繁殖期能量需求最高的階段，許多動物會通過提高攝食量來滿足能量需求的增加。本研究發現，LP組黑線倉鼠哺乳期攝食量顯著增加，而UP組未顯著增加，哺乳高峰期最大攝食量比LP組低36.2%，消化能和糞能也顯著降低，研究結果支持“熱耗散限制假說”。趙志軍(2015)對比了低溫(5 ℃)、室溫(21 ℃)和暖溫(30 ℃)下黑線倉鼠哺乳期能量攝入，發現暖溫組和室溫組的攝入能和繁殖輸出差異不顯著。Huang等(2020)發現哺育大胎仔數的母體能量收支在30 ℃下受到顯著抑制，而哺育小胎仔數的未發生顯著變化。然而，在30 ℃下小鼠哺乳期攝食量顯著低于室溫對照組(Król & Speakman，2003；Zhaoetal.，2020)。顯然，這些研究結果并不一致，原因可能在于動物的散熱能力具有種間差異。與小鼠相比，黑線倉鼠的代謝率相對較高，因此散熱能力對哺乳期最大能量收支限制的水平也較高(Wenetal.，2017)，30 ℃暖溫的環境未達到其限制水平。此外，30 ℃處于TNZ內，而本文設計的高溫為32.5 ℃，恰好處于黑線倉鼠TNZ的上臨界點，結合本研究結果，表明TNZ的上臨界溫度可能導致黑線倉鼠的“熱耗散限制”，動物散熱能力導致的哺乳期最大能量收支限制是溫度依賴性的，與動物所處的環境溫度密切相關。

哺乳期能量攝入的增加主要用于滿足能量需求，如BMR、行為活動或后代生長發育(通過泌乳)的能量支出等(Kenagyetal.，1990；趙志軍，2011，2015)。在哺乳期最大能量收支受到限制的條件下，動物在自身維持和哺育后代之間存在權衡，通過降低維持將更多的能量分配于后代的生長發育，本研究發現UP組的RMR和泌乳能量支出顯著低于LP組，導致幼體的體質量顯著降低，這與“熱耗散限制假說”的預測一致(Król & Speakman，2003)，表明散熱能力對最大能量收支限制水平與環境溫度有關。

本研究中UP組的RMR和熱傳導率顯著低于LP組，表明上臨界溫度使母體的熱耗散能力受到抑制，導致機體面臨體溫異常升高的風險更大，因此母體必須降低能量代謝效率以減少代謝產熱。此外，由于不同物種的TNZ及其上、下臨界點溫度存在明顯差異，特定的環境溫度對不同動物來講意義不同。例如，Pan等(2014)研究發現，暴露于上臨界點溫度的長爪沙鼠Merionesunguiculatus的代謝產熱顯著降低。這些研究結果表明，TNZ上臨界點溫度對哺乳期動物的代謝水平和熱傳導率具有顯著影響。

BAT是小型哺乳動物主要的產熱來源，其線粒體密度高，線粒體內膜分布的UCP1使氧化和磷酸化解偶聯，形成質子漏，發揮產熱作用(葉祖承，蔡益鵬，1994；李慶芬等，2001)。本研究發現，UP組的BAT UCP1mRNA表達顯著低于LP組，表明高溫環境下哺乳期動物的BAT產熱受到抑制。已有研究發現，為防止體溫上升，許多動物哺乳期代謝活性組織產熱能力受到顯著抑制，包括BAT質量顯著減少，UCP1mRNA表達顯著下調，BAT產熱顯著降低(趙志軍等，2014)。本研究表明，哺乳期BAT代謝產熱活性也隨溫度升高而顯著減弱，這與Pan等(2014)的研究結果相似，支持“熱耗散限制假說”。

催乳素是一種由垂體前葉分泌的蛋白質激素，具有發動并維持泌乳的作用。幼體吸吮刺激會反射性增加催乳素的分泌(Rillema & Bell，2007)。本研究發現，UP組的黑線倉鼠血清催乳素水平與LP組相比未發生顯著變化。而高溫下小鼠盡量減少哺乳時的聚群效應，以防體溫升高，表現為頻繁中斷哺乳，導致催乳素合成和分泌減少，被認為是“熱耗散限制假說”的內分泌機制之一(Speakman & Król，2011；Zhaoetal.，2016)。然而本研究結果與小鼠的不一致，暗示散熱能力對最大能量收支影響的調節機制可能存在種間差異。催乳素參與下丘腦與攝食調控相關的神經肽(比如NPY和AgRp等)的表達(Friedman & Halaas，1998)。已有研究表明，哺乳期大鼠的NPY mRNA表達顯著上調，暗示NPY在哺乳期發揮刺激攝食的重要作用(Malabuetal.，1994)。但本研究發現，黑線倉鼠下丘腦NPY和AgRp基因的mRNA表達在TNZ上、下臨界點溫度間無顯著差異，表明高溫下哺乳期最大能量收支的熱耗散限制可能與下丘腦NPY和AgRp基因的mRNA表達無關。

總之，與LP組相比，UP組的黑線倉鼠熱傳導率顯著降低、能量攝入和泌乳能量支出受到顯著抑制，導致繁殖輸出顯著減少。UP組的BAT UCP1mRNA表達顯著下調，表明高溫環境下哺乳的動物BAT產熱受到抑制，研究結果支持“熱耗散限制假說”。TNZ上、下臨界點溫度組間的血清催乳素水平、下丘腦NPY和AgRp基因的mRNA表達差異不顯著，表明催乳素介導的神經內分泌調節機制可能未參與高溫下黑線倉鼠哺乳期最大能量收支的熱耗散限制。