2種斑魚蛉(廣翅目：齒蛉科：魚蛉亞科)幼蟲和蛹的分類鑒定及形態描述

沈載蕓， 曹成全*， 王向積， 劉方慶， 楊香宇

(1. 樂山師范學院生命科學學院，四川樂山614004； 2. 山東省青島市城陽區農業農村局, 山東青島266109)

魚蛉亞科Chauliodinae隸屬于廣翅目Megaloptera齒齡科Corydalidae，在齒蛉科中，魚蛉亞科較齒蛉亞科Corydalinae的屬級分化更明顯(劉星月，2008)，該亞科世界己知15屬130余種，世界性分布，呈現明顯的間斷分布格局(劉星月，2008；楊定，劉星月，2010)。斑魚蛉屬Neochauliodes是魚蛉亞科中最大的屬，世界已知38種及2亞種，分布廣泛，從遠東一直延伸到東南亞(劉星月，2008；王付彬，2010；楊定，劉星月，2010)，其中，《中國動物志昆蟲綱(第五十一卷廣翅目)》(楊定，劉星月，2010)中的東方斑魚蛉Neochauliodesorientalis和越南斑魚蛉Neochauliodestonkinensis為同物異名。

在中國乃至世界的廣翅目昆蟲分類研究中，成蟲的分類學研究較為完善(劉星月，2008；楊定，劉星月，2010)，但其余蟲態的分類研究卻很薄弱。世界上多個現存廣翅目幼蟲形態特征已被描述，包括：馬達魚蛉屬Madachauliodes(Paulian，1951)、魚蛉屬Chauliodes和黑魚蛉屬Nigronia(Cuyler，1958，1965)、帝魚蛉屬Dysmicohermes、新魚蛉屬Neohermes和山魚蛉屬Orohermes(Evans，1972)、原泥蛉屬Protosialis(Flint，1973)、麗魚蛉屬Chloronia(Penny & Flint，1982)、寬頭齒蛉屬Platyneuromus(Contreras-Ramos & Harris，1998)、異魚蛉屬Apochauliodes、始魚蛉屬Archichauliodes、原魚蛉屬Protochauliodes、澳泥蛉屬Austrosialis和細泥蛉屬Stenosialis(Theischinger，2000)、星齒蛉屬Protohermes、斑魚蛉屬、準魚蛉屬Parachauliodes、日泥蛉屬Nipponosialis和泥蛉屬Sialis(Hayashi，2005)、新齒蛉屬Corydalus(Azevêdo & Hamada，2006，2007)、寬魚蛉屬Platychauliodes和梯魚蛉屬Taeniochauliodes(Liuetal.，2011，2013)、纖泥蛉屬Leptosialis(Priceetal.，2012)、巨齒蛉屬Acanthacorydalis(Cao & Liu，2013)和齒蛉屬Neoneuromus(Caoetal.，2016，2018)等，斑魚蛉屬的小碎斑魚蛉N.sparsus(王付彬，2011)和臺灣斑魚蛉N.formosanus(Sang & Yeon，2015)的形態也被描述過。

僅有少數屬的蛹形態特征被描述過：星齒蛉屬和斑魚蛉屬(王付彬，2011)、巨齒蛉屬和齒蛉屬(Cao & Liu，2013; Caoetal.，2016，2018)。

本文利用分子數據和成蟲形態特征雙重證據對雙齒斑魚蛉Neochauliodesbicuspidatus和越南斑魚蛉的末齡幼蟲和蛹進行了分類鑒定，并對其形態特征進行了詳細描述。

1 材料與方法

1.1 試蟲采集及處理

試驗所用末齡幼蟲于2019年3月和2020年3月采自四川省涼山彝族自治州會理縣南閣鄉涼橋村(102°17′42″E，26°36′58″N，海拔1 900 m)，2種斑魚蛉生活在一起而常被同時采集到，均采集于山林一條流速緩慢的小河溝中，常居于石頭下，在無石頭區域的厚積腐葉下也采集到少量。

每個種類采集50～100只，將采集回的活蟲按照相關技術進行養殖(曹成全等，2018a，2018b)，將試蟲養至蛹和成蟲。

1.2 幼蟲和蛹的形態學研究

將處理干凈的鮮活完整幼蟲和蛹置于有蓋的培養皿中，0 ℃保存1 d以上冷凍休眠，取出置于空氣中0.5 h左右，使其肢體自然伸展，調整標本姿勢，在LY-WN-YH全自由度超景深系統(成都勵揚精密機電有限公司)下拍攝,并用校準的卡尺測量數據，體長從唇基到腹部末端測量，頭部長度從唇基到頭后測量(0.01 cm)。將拍攝好的試蟲進行標注，并用Photoshop CS6處理。

1.3 試蟲物種鑒定

1.3.1 成蟲形態學鑒定將試蟲養殖至成蟲后，按照楊定和劉星月(2010)中的方法進行形態學鑒定。

1.3.2 幼蟲和蛹的分子鑒定DNA提取：剪取樣本胸腹部肌肉，取完后用消毒后的小剪刀剪碎，再采用基因組DNA試劑盒(北京天根生物科技)提取總的基因組DNA。

PCR擴增以及測序：COⅠ序列通用引物為C1-J-2183(5’-CAACATTTATTTTGATTTTTTGG-3’)和TL2-N-3014 (5’-TCCATTGCACTAATCTGCCAT-ATTA-3’)(張杰，2017)。PCR反應體系為 25 μL，包括2×ES TaqMasterMix(cye) 12.5 μL，引物各1.0 μL(0.4 μmol)，ddH2O 8.5 μL，樣品2 μL。擴增程序為94 ℃ 1 min；94 ℃ 0.1 min，55 ℃ 0.5 min，72 ℃ 1 min，20個循環；94 ℃ 0.5 min，45 ℃ 0.5 min，72 ℃ 1 min，20個循環；72 ℃ 10 min，4 ℃ ∞，1個循環。經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，PCR產物送生工生物技術(上海)公司成都生工測序部進行純化和雙向測序。

數據處理：測序后先在GenBank上對比，然后再上傳獲得GenBank登錄號；同時，將所得序列與其他物種建立系統聚類樹以比較遺傳距離：外類群和其他內類群的DNA序列下載自GenBank，包括櫛角魚蛉Chauliodespectinicornis(KR148304.1)、污翅斑魚蛉N.fraternus(KF785799.1)、緣點斑魚蛉N.bowringi(JQ351950.1)、圓端斑魚蛉N.rotundatus(KF771894.1)、散斑魚蛉N.punctatolosus(JX110703.1)和碎斑魚蛉N.parasparsus(AQU14296.1)，利用DNAman程序打開序列，與峰圖軟件(Chromas)對齊以及與BioEdit進行序列比對，檢查變異序列并剪掉不必要的序列，然后保存為.pir文件，再將此文件導入DanSP 5.0中，生成.nex單倍型文件。再使用Primer，與從GenBank上獲得的COⅠ序列重新命名，在PAUP 4.10中運行NJ 樹，設置重復1 000代，得到的樹文件(.tre)通過FigTree 1.4.4進行可視化和樹的美化，同時利用bootstrap(1 000次重復)檢驗各分支的支持率，物種兩兩之間的遺傳距離通過MEGA 6.0(Tamuraetal.，2013)中的P-distance遺傳距離方法計算。

2 結果與分析

2.1 試蟲物種鑒定

試蟲養殖至成蟲后，通過形態鑒定，確定為雙齒斑魚蛉和越南斑魚蛉。2種試蟲的幼蟲和蛹的COⅠ序列GenBank登錄號分別為：MW560981和MW560982。

7種斑魚蛉的COⅠ種間遺傳差異為0.089～0.210(表1)，雙齒斑魚蛉和越南斑魚蛉與斑魚蛉屬其他物種的種間遺傳距離范圍分別為0.111～0.190和0.099～0.176。在NJ系統發育樹中，雙齒斑魚蛉和越南斑魚蛉分別形成了單獨的分支(圖1)，支持率為63.1%，與碎斑魚蛉聚在一起形成姐妹群，支持率為55.2%，污翅斑魚蛉和圓端斑魚蛉聚集在一起，支持率為99.9%。

表1 基于COⅠ序列數據的斑魚蛉屬部分物種之間的遺傳距離Table 1 Genetic distance between some species of the genus Neochauliodes based on COⅠ sequence data

2.2 幼蟲形態描述

2.2.1 雙齒斑魚蛉末齡幼蟲體長5.10 cm±0.01 cm，體寬0.75 cm±0.05 cm(n=10)(表2)，身體較為粗壯，頭和前胸背板為黑色或黑棕色且基本無花紋，通體呈棕色或棕褐色(圖2：A、B)。

表2 雙齒斑魚蛉和越南斑魚蛉末齡幼蟲形態測量Table 2 Morphometric information of the final-instar larvae of Neochauliodes bicuspidatus and N. tonkinensis

頭部：長0.55 cm±0.05 cm，寬0.55 cm±0.15 cm。上唇圓形，淡黃色，中部具有2個暗褐色斑紋和幾根剛毛。上顎黑色且光滑，骨化明顯。外顎葉黃白相間且上面被毛，下顎棕色。觸角長0.21 cm±0.01 cm，4節，棕色，第2節最長，第2節約是第4節的1.80倍，觸角的近似比例為4∶9∶3∶5。頭部腹面無明顯的花紋，多凹點(圖2：C)。

胸部：前胸寬0.70 cm±0.01 cm，長0.60 cm±0.01 cm，中后胸長寬基本一致。前胸背板黑色或黑棕色，光滑，兩側具細長剛毛，前胸背板腹面前緣有4道黃色豎線，中上部有1個半月牙形紅棕色骨化片；中后胸背板具有較復雜且左右對稱的黑色花紋。足棕色，每個足末端各有2個小爪子，足兩側密被剛毛，每只足腹面的前側毛少于后側毛且長毛和短毛間隔排列(圖2：D、E、F)。

腹部：長3.12 cm±0.10 cm，10節，腹節寬度呈遞減趨勢，與相應呼吸鰓比例近似為 1.14∶1.15∶1.15∶0.94∶0.88∶0.97∶0.69∶0.56(表3)。蟲體表面密被短鈍剛毛，每一腹節有明顯的居中橫狀無毛區；腹面比背面顏色鮮艷，每一腹節都有“∵”形(圖2：G，圖3：A、B、C)的大黃斑點，因體色、體型的差異，顏色和大小存在細微不同。斑點中央具1個短粗黑斑，腹節中部長短不一的橫狀無毛區與下方斑點組成類似“T”型的區域，但兩者并未直接相連(圖2：G)。腹節左右兩側有對稱的3、4條短線無毛區。第8腹節后緣有1對呼吸管，呼吸管長0.20 mm±0.03 mm，第10腹節尾端兩側各有1對骨化的鉤子(圖2：H)，其基部棕黃色，頂端棕黑色。第6腹節的寬度和氣管鰓長度變化明顯。背面棕色，表面斑點可能被覆蓋(圖3：D)，少數為棕褐色，表面具有細碎黃色斑點(圖3：E、F)。

表3 雙齒斑魚蛉和越南斑魚蛉末齡幼蟲腹節及對應氣管鰓測量Table 3 Morphometric information of the abdominal sections and tracheal gills of the final-instar larvae of Neochauliodes bicuspidatus and N. tonkinensis

2.2.2 越南斑魚蛉末齡幼蟲越南斑魚蛉末齡幼蟲與雙齒斑魚蛉末齡幼蟲整體較相似(圖4:A、B)，前者除整體體色略淡外，其他不同之處如下：

體長5.15 cm±0.15 cm，體寬0.59 cm±0.01 cm(n=10)，身體較為纖細，額部具有明顯“∵”形淡黃色單眼(圖4：C)，前胸背板具有復雜花紋(圖4：D)，光滑，身體附有密集、大小不等的黃色斑點，腹面斑紋存在變異。

頭部：長0.48 cm±0.03 cm，寬0.45 cm±0.05 cm，頭部紅棕色或棕黑色，額部有可見的“∵”形淡黃色單眼(圖4：C)。觸角長0.20 cm±0.01 cm，4節，棕色，第2節和第4節最長，第2節約是第4節的1.50倍，觸角的近似比例為3∶9∶2∶6。

胸部：前胸背板長0.53 cm±0.03 cm，寬0.45 cm±0.05 cm，紅棕色或棕黑色，具有復雜花紋(圖4：D)，兩側具有細長纖毛，中后胸長寬幾乎相等，近方形，具有復雜對稱的花紋(圖4：E)，足端的2個小鉤及跗節部分上的毛明顯少于雙齒斑魚蛉(圖4:F、G)。

腹部：長度3.50 cm±0.01 cm，灰褐色或棕色，腹節寬度先略增后減少，呼吸鰓明顯修長，尤其第6～8節，每個腹節與對應呼吸鰓的長度比例關系為0.93∶0.89∶0.89∶0.94∶0.79∶0.71∶0.56∶0.34(表3)。背面具有密集、大小不等的黃色斑點(圖4：H)，且每一腹節前后各有1對由細碎小斑點聚集成的較大黃色斑點(圖4：H)和明顯的橫線和斜線(圖4：H)。腹面每節兩側有2條彎曲的線條(圖4：I)。腹部第8節后緣有1對呼吸管(圖4：J)，呼吸管長0.18 cm±0.05 cm。

腹部腹面斑紋存在一定的變異，經統計共有2種斑型(n=20)：Ⅰ型約25%，Ⅱ型約60%，約15%的個體兼具2種斑型。Ⅰ型斑紋a、b兩者近似平行(圖5：A、B)，ⅠA型斑紋的a、b、c部分大小近似相等，比ⅠB型斑紋的相應部分略寬且d區域較窄；Ⅱ型斑紋a、b兩者成分開趨勢(圖5：C、D)，ⅡA型斑紋的c部分比ⅡB型斑紋的寬。

2.3 蛹形態描述

2.3.1 雙齒斑魚蛉蛹形態描述在自然狀態下，蛹呈“C”形彎曲，體色根據時間而變化：剛化蛹1 d時頭部、觸角、胸背板及2對翅芽嫩黃色，腹部黑褐色，3～4 d時體色幾乎變為黑色(圖6：A、B、C)，直至快羽化時體色會再加深。頭部較短粗，近與前胸等寬，頭頂近三角形，有一些長的剛毛；觸角絲狀，彎曲到頭部的腹面。復眼卵球形，突出。唇短于頭部，大顎與末齡幼蟲相似，前半部分黑色，后半部分棕紅色，有黑色斑點(圖6：B、D)。前胸長度稍短于寬度，中胸和后胸較為健壯，有黑色無規則的斑點，表面被附有較多細毛；2對翅芽健碩；腹部飽滿粗壯，腹面可見類似其末齡幼蟲的斑紋，腹部第9節背腹面具有細長密集的毛(圖6：E、F)，生殖器發育完全。

2.3.2 越南斑魚蛉蛹形態描述越南斑魚蛉蛹與雙齒斑魚蛉蛹整體較相似，后者除整體體色略深、體色變化較快外，其他不同之處如下：

前額凹陷明顯；復眼卵球形，棕褐色；大顎棕色，與其末齡幼蟲相似；腹部腹面有較清晰的斑紋，且每個腹節兩側的下角處有黑點狀斑紋，背面有明顯、細碎、大小不一的黃色斑塊(圖7：A、B、E)；生殖器發育健全，腹面飽滿、光滑無毛(圖7：F、G、H)。

根據發育時間，蛹期體色從嫩黃色(圖7：C)到金黃色(圖7：A、B)再到黑色(圖7：D)，翅芽變化尤其明顯。

3 結論

雙齒斑魚蛉末齡幼蟲除了體色上略有差異，總體特征相對穩定，而越南斑魚蛉末齡幼蟲種內形態特征差異較大。兩者之間較為穩定的形態特征差異見表4。

表4 2種斑魚蛉末齡幼蟲形態差異Table 4 Morphological difference of the larvae of two species of Neochauliodes

2種蛹的形態特征總體上差異不大，具體差異為：前者蛹體色較深，隨時間體色變化大，后者即便是羽化前1～2 d也只是2對翅芽顏色加深近黑色，頭、觸角及胸背板部分變棕黑色；前者的腹部第9節背腹面有密集纖長的剛毛，而后者相同部位光滑，幾乎無毛。

形態上的差異性狀對于2種斑魚蛉幼蟲和蛹的鑒別具有一定的參考價值，但幼蟲的花紋和體色變異較大，不易作為穩定的鑒別特征，且蛹的體色會隨時間而不斷改變。

4 討論

本研究形態學結果顯示，雙齒斑魚蛉和越南斑魚蛉與其他物種存在明顯的差異；系統發育分析也表明，雙齒斑魚蛉和越南斑魚蛉在系統發育樹中分別形成了2個單獨的分支，因此認為兩者很可能為2個獨立的物種；然而，由于樣本獲取難度大，雙齒斑魚蛉和越南斑魚蛉樣本較少，本研究中分子生物學數據較為單薄，不排除后期研究中在獲取更多樣本后，系統發育樹結果與形態學結果不一致的情況，即雙齒斑魚蛉種群和越南斑魚蛉種群聚在一起，形成一個大的分支，表明兩者形態學的差異是由于個體變異導致。例如，雙齒斑魚蛉末齡幼蟲的足和一些呼吸鰓末端具有黑色斑點，是因受傷導致，或者受環境尤其是水質的影響。因此，在后期研究中將進一步補充更多的樣本，對現有結果進行驗證，以明確雙齒斑魚蛉和越南斑魚蛉的分類和系統發育地位。

致謝：感謝中國農業大學劉星月教授協助鑒定物種并對論文撰寫提出寶貴意見，感謝沈華瑞、何緒康、沈載富等在標本采集和養殖過程中的協助和支持。