大體積固相萃取/高效液相色譜-串聯質譜法測定地表水中的五氯酚

楊 霄，李小玲，劉伶俐，洪 波，萬譯文

(1.湖南省水產科學研究所，中國 長沙 410153；2.農業農村部漁業產品質量監督檢驗測試中心(長沙)，中國 長沙 410153)

五氯酚(pentachlorophenol，簡稱PCP，分子式C6HCl5O)，是一種氯代芳香族有機污染物，具有致癌、致畸、致突變的毒副作用，曾作為除草劑、殺菌劑、防腐劑及生物殺滅劑等在工農業生產中廣泛運用[1,2]。五氯酚化學性質穩定，在環境中易殘留、難降解，可通過生物富集進入生物鏈；五氯酚的鈉鹽易溶于水，在水體中可廣泛擴散，從而造成環境污染和生物蓄積[3,4]。由于毒性大、難降解及污染面廣，五氯酚已經被中國等諸多國家列為優先污染物黑名單[5]。我國地表水環境質量標準 (GB 3838)中規定五氯酚的限量值為0.009 mg·L-1。開發簡單、快速及靈敏的五氯酚檢測方法對于環境監測和污染物治理具有重要意義。目前，五氯酚的測定方法主要為氣相色譜法(GC)[6,7]、氣相色譜-串聯質譜法(GC-MS)[8,9]、高效液相色譜法(HPLC)[10,11]、高效液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)[12,13]以及電化學分析法[14,15]等，其中HPLC-MS/MS靈敏度高、選擇性好，且不需要繁雜的衍生操作，具有廣泛的適用性。地表水中的五氯酚含量通常為痕量或超痕量水平，研究者多采用固相萃取小柱(規格為3 mL或6 mL)萃取富集大體積的水樣(取樣量為500 mL或1 000 mL)，以實現目標物高倍數富集和預分離[7,11，12]。

固相萃取(solid-phase extraction，SPE)，是一種用于水樣或其他液體樣品中對目標組分具有富集和凈化作用的經典前處理技術[16]。與液液萃取相比，SPE具有易于操作、有機試劑用量少、萃取回收率高等優點。但在實際應用中，固相萃取技術也存在一定的局限性。由于地表水中五氯酚含量較低，需要增大上樣量進行大體積固相萃取，以實現五氯酚的靈敏可靠檢測。然而傳統的固相萃取技術一般適用于小體積萃取，對于大體積水樣，已有的研究報道主要采用以下兩種方式進行固相萃取：(1)采用大體積樣品采樣器進行固相萃取的上樣過程，但需購置專門的設備，費用昂貴；(2)反復多次向固相萃取小柱內注入液體樣品，但操作強度大且容易因操作不當造成樣品之間的交叉污染。因此，必須針對大體積水樣固相萃取的特點，制作簡單可靠的萃取裝置，以實現對地表水中五氯酚的高效率萃取。

本研究采用商用的固相萃取小柱、轉接頭以及空柱管為基本元件，設計制作一種簡單、環保、低成本的大體積固相萃取裝置。并以水樣中五氯酚為檢測對象，評價該裝置的萃取富集性能。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TSQ Quantum Access液相色譜-串聯質譜儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)；氮吹儀(美國Organomation公司)；漩渦混勻儀(美國SCILOGEX公司)；固相萃取儀(美國Supelco公司)；和泰實驗室純水系統(上海和泰儀器有限公司)。HLB固相萃取小柱(6 mL/500 mg)、轉接頭(PP材質，1，3，6 mL通用)、60 mL空柱管(PP材質，內徑26 mm，長度130 mm)均購自上海安譜實驗科技股份有限公司。

五氯酚標準物質(100±0.13 mg·L-1，農業部環境保護科研監測所)；甲酸(LC-MS級，美國Sigma公司)；乙酸銨(HPLC級，美國Fluck公司)；甲醇(HPLC級，德國Merck公司)；實驗用水為超純水(18.2 MΩ·cm)。

1.2 大體積固相萃取裝置的組裝

圖1 大體積固相萃取裝置示意圖Fig. 1 Schematic illustration of the large-volume SPE device

取HLB固相萃取小柱、轉接頭及空柱管各一個，將其按順序依次連接后即組裝成大體積固相萃取裝置(見圖1)。將該裝置置于固相萃取儀上即可進行批量固相萃取過程。每次實驗完畢，固相萃取轉接頭和空柱管用中性洗滌劑清洗干凈，再用水和甲醇洗滌，于室溫下晾干后可反復使用。

1.3 樣品前處理

水樣用微孔濾膜 (0.45 μm)過濾后，取100 mL樣品，用甲酸調節pH至3左右。用5 mL甲醇和5 mL水活化HLB固相萃取小柱，然后將水樣分兩次轉移至大體積固相萃取裝置中，在抽真空的情況下過柱(保持流速3 mL·min-1)。待水樣全部過完后，將空柱管和轉接頭除去，向HLB小柱中加入5 mL水淋洗并抽干，用5 mL甲醇洗脫小柱，收集全部洗脫液，于45 ℃下氮吹至干。用1.00 mL 甲醇渦旋溶解殘留物，過0.22 μm 微孔濾膜后，供HPLC-MS/MS測定。

1.4 標準曲線的繪制

根據需要，臨用時準確吸取一定量的五氯酚標準溶液(100 mg·L-1)，用甲醇稀釋配制成質量濃度為1.0，2.5，5.0，10.0，25.0和100.0 μg·L-1的標準工作溶液，上機測定。采用外標法定量，以被測組分的質量濃度x(μg·L-1)為橫坐標，色譜峰面積(y)為縱坐標，制作標準曲線。

1.5 色譜-質譜條件

1.5.1 色譜條件 Waters Atlantis C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 3.0 μm)；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL；流速為0.3 mL·min-1；流動相A為水溶液(含2 mmol·L-1乙酸銨和0.1%(體積分數)甲酸)；流動相B為甲醇；梯度洗脫程序：0～1.0 min, 40%B； 1.0～2.0 min, 40%～100%B； 2.0～6.0 min, 100%B； 6.0～8.0 min, 100%～40%B； 8.0～10.0 min, 40%B。

1.5.2 質譜條件 電噴霧離子源 (ESI)，選擇反應監測(SRM)；噴霧電壓為～3 kV；離子傳輸管溫度為300 ℃；霧化器溫度為300 ℃；鞘氣壓力設為40，輔助氣壓力設為10，碰撞氣壓力199.983 mPa。定量離子對為m/z264.7/264.7; 定性離子對m/z262.7/262.7，m/z266.7/266.7，m/z268.7/268.7;碰撞能量:～5 eV。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

圖2 五氯酚的質譜圖Fig. 2 Mass spectrum of PCP

五氯酚是一種氯代酚，其分子結構為苯環上含有1個羥基和5個氯原子，容易失去質子帶負電荷，在負離子模式 ([M—H]-) 下具有高檢測靈敏度。在ESI-模式下將五氯酚標準溶液 (μg·L-1)以流動注射方式注入質譜中，在一級質譜掃描條件下獲得目標物化合物的分子離子([M—H]-)，優化噴霧電壓、離子傳輸管溫度、鞘氣壓力、輔助氣壓力等參數。然后采用二級質譜掃描方式獲取母離子對應的各特征子離子，發現五氯酚 [M—H]-對應的特征子離子響應很低，這可能是由于 [M—H]-在質譜中很難被打碎。由于五氯酚結構中含有5個氯原子，而氯元素存在35Cl與37Cl同位素，因此五氯酚的分子離子([M—H]-)共有氯的4個同位素母離子對。選取相對強度最大的母離子對264.7/264.7作為定量離子對，次強的母離子對(262.7/262.7，266.7/266.7，268.7/268.7)作為定性離子對，確定如1.5.2節所述的質譜條件。五氯酚的質譜圖如圖2所示。

2.2 色譜條件

圖3 不同流動相條件下五氯酚的SRM色譜圖 Fig. 3 SRM chromatograms of PCP

五氯酚的 pKa為4.93，當溶液的pH<4.93時，五氯酚的電離受到抑制，主要以分子形式存在。當流動相中添加甲酸時，溶液的pH值顯著降低，不僅能抑制五氯酚的電離，而且還可以減小目標物與色譜柱殘留硅羥基的相互作用，從而改善色譜峰的峰形[3]。在流動相中加入乙酸銨可以提高五氯酚的離子化效率，進而增強靈敏度。本實驗比較了不同色譜條件下五氯酚的SRM色譜圖(如圖3所示)，結果表明，流動相采用0.1%(體積分數)甲酸水溶液(含2 mmol·L-1乙酸銨)和甲醇時，五氯酚表現出最佳的靈敏度和色譜峰型。

2.3 固相萃取條件的優化

水樣中有毒有害物質的含量很低，固相萃取可以對水樣中目標物進行有效富集，從而提高檢測靈敏度。固相萃取的條件影響目標物的萃取回收率，實驗過程必須對固相萃取條件進行優化。本實驗主要考察了pH值、固相萃取柱的選擇、洗脫劑的選擇和洗脫劑的用量對目標物萃取效率的影響。

2.3.1 水樣的pH值 五氯酚的pKa為4.93，在酸性溶液中電離受到抑制，主要以分子形態存在，在中性和堿性溶液中可電離成離子形態。水樣酸堿度的變化會直接影響五氯酚的分子解離和帶電荷狀況，進而影響后續的HLB柱固相萃取效果。在100 mL空白水樣中添加0.2 mL五氯酚標準溶液(100 μg·L-1)后，渦旋混勻，得到0.20 μg·L-1的加標水樣。分別用甲酸或氨水將加標水樣的pH調節至1，2，3，4，5，6，7，8和9。按1.3節方法處理后上機測試分析，比較水樣pH值對目標物萃取效率的影響(見表1)。從表1可以看出，過低或過高的pH值均可造成目標物的回收率降低，當pH=3時，五氯酚的回收率最高，故本實驗確定pH=3為水樣預處理條件。

表1 水樣pH對五氯酚回收率的影響(n=3)

2.3.2 固相萃取柱的選擇 本實驗采用C18(500 mg，6 mL)，ENVI-Chrom(250 mg，6 mL)及HLB(200 mg，6 mL)3種固相萃取柱對五氯酚的萃取效率進行比較研究。結果如表2所示，采用HLB柱的回收率為95.6%，顯著高于采用C18柱和ENVI-Chrom柱的回收率，這說明HLB柱對五氯酚的富集效果優于C18柱和ENVI-Chrom柱，因此，本實驗選擇HLB固相萃取柱。

表2 不同的固相萃取柱對五氯酚回收率的影響 (n=3)

為了進一步探求不同品牌的HLB固相萃取柱對五氯酚萃取效率的影響，本實驗對比3個主流品牌的HLB固相萃取柱(Waters Oasis, 200 mg, 6 mL; Simon Aldrich, 150 mg, 6 mL; CNW Poly-Sery, 200 mg, 6 mL;)對0.20 μg·L-1的加標水樣中目標物萃取回收率的影響(如表3所示)。結果表明，不同生產廠商的C18固相萃取柱對水樣中五氯酚的萃取率沒有顯著差異。

表3 不同品牌的HLB固相萃取柱對五氯酚回收率的影響 (n=3)

2.3.3 洗脫劑的選擇 選擇合適的洗脫劑將目標物從吸附劑上洗脫下來是整個萃取過程的關鍵[17]。本實驗考察了4種洗脫劑(甲醇、乙腈、二氯甲烷、丙酮)對五氯酚的洗脫效果(表4)。結果表明，甲醇的洗脫效果比乙腈、二氯甲烷和丙酮更好，目標物回收率更高，因此本實驗選擇甲醇作為洗脫劑。

表4 不同的洗脫劑對五氯酚回收率的影響 (n=3)

圖4 洗脫劑用量對五氯酚回收率的影響 (n=3)Fig. 4 Effect of amount of eluents on recovery of PCP (n=3)

2.3.4 洗脫劑的用量 洗脫劑用量少不能將目標物從固相萃取柱上洗脫下來，用量多則造成洗脫劑浪費，因此，洗脫劑的用量選擇很重要。采用甲醇為洗脫劑，考察洗脫劑用量(2，3，4，5，6，7 mL)對萃取效率的影響(圖4)。結果表明，當洗脫劑的用量在2～5 mL范圍內增加時，五氯酚的回收率顯著提高；當洗脫劑用量為5 mL時，回收率達到最大；當洗脫劑超過5 mL時，隨著洗脫劑用量增大回收率變化差異不大。為了縮短氮吹時間，提高工作效率，確保回收率穩定，本實驗選擇5 mL甲醇作為洗脫劑。

2.4 大體積固相萃取裝置萃取性能的研究

為了評價大體積固相萃取裝置的萃取性能，本實驗分別采用1.3節自制的大體積固相萃取裝置和HLB小柱進行五氯酚的固相萃取過程。具體評價方法為：取空白水樣，添加0.5 μg·L-1的五氯酚后，分成兩組，每組10個樣品。第一組樣品采用1.3節的方法進行前處理，第二組樣品將大體積固相萃取裝置換成HLB小柱后按照相同的方法進行前處理。實驗結果如下：第一組樣品五氯酚的平均回收率為96.5%，相對標準偏差為4.16%，第二組樣品五氯酚的平均回收率為94.8%，相對標準偏差為6.79%。結果表明，兩組樣品測定結果的回收率和相對標準偏差差異不大，表明采用大體積固相萃取裝置和HLB小柱進行固相萃取時萃取性能均滿足檢測方法的要求。然而，與本實驗開發的檢測方法相比，采用HLB小柱進行固相萃取時，檢測過程勞動強度更大，更繁瑣耗時(單個樣品約需上樣20次)，不利于大批量樣品的快速檢測。

綜上所述，本實驗自制的大體積固相萃取裝置，具有萃取性能佳、操作簡單、勞動強度低的特點，適用于大體積水樣的固相萃取。

2.5 方法學驗證

2.5.1 線性范圍和靈敏度 按照1.4節的方法配制標準工作溶液，上機測定，制作標準曲線。在空白水樣中添加低濃度的五氯酚標準溶液，按照1.3節的方法處理后上機測定，以信噪比(S/N)為3和10分別確定五氯酚的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。五氯酚的線性范圍、標準曲線、相關系數、檢出限和定量限見表5。由表5可知，五氯酚在1～100 μg·L-1的濃度內線性關系良好，方法的檢出限和定量限低，表明本方法適用于水體中五氯酚的定量分析。

表5 五氯酚的線性范圍、標準曲線、相關系數、檢出限和定量限

圖5 池塘水樣添加樣品(0.5 μg·L-1)的SRM色譜圖Fig. 5 SRM chromatograms of the pond water sample spiked with PCP(0.5 μg·L-1)

2.5.2 方法的回收率和精密度 選取不含五氯酚的4種類型的地表水水樣作為空白樣品，分別添加0.02，0.5，5.0，10.0 μg·L-1的五氯酚標準溶液，按照本方法進行回收率和精密度實驗。空白水樣添加回收率實驗結果見表6，池塘水樣添加樣品(0.5 μg·L-1)的SRM色譜圖見圖5。從表6可以看出，五氯酚的回收率在76.5%～101.2%，相對標準偏差(RSD)均小于10%，表明該方法的回收率高，精密度好，適用于地表水中五氯酚的檢測。

表6 空白水樣添加回收率和方法精密度實驗(n=6)

2.6 與其他方法的比較

將本實驗建立的大體積固相萃取結合高效液相色譜串聯質譜檢測五氯酚的方法與已經報道的檢測方法進行對比(見表7)可以發現，本方法具有線性范圍寬、檢出限低和回收率高等優點。更為重要的是，本方法固相萃取過程中水樣取樣量更少，單次上樣量大，勞動強度更低。這表明，本實驗建立的方法具有較好的應用前景，可以作為一種簡便、快速、高效的檢測水體中五氯酚含量的新方法。

表7 與其他檢測水樣中五氯酚的方法對比

2.7 實際樣品檢測

為了驗證方法的可靠性和實用性，采用本實驗優化的前處理方法和儀器條件對湖南省某市的10個池溏、5個湖泊和5個水庫的水樣進行檢測，結果表明，池溏水樣中五氯酚的質量濃度在0～1.05 μg·L-1，湖泊水樣中五氯酚為0～0.27 μg·L-1，水庫水樣中五氯酚的質量濃度在0～0.11 μg·L-1，均未超過我國地表水環境質量標準規定的限量值0.009 mg·L-1。本方法靈敏度高，操作簡單高效，適合批量測定水樣中五氯酚的質量濃度，可以為分析和監測地表水中五氯酚的分布狀況和污染特征提供技術支持。

3 結論

本實驗以自制的大體積固相萃取裝置對水樣中五氯酚進行固相萃取，優化了水樣的pH值、固相萃取柱的選擇、洗脫劑的選擇和用量等固相萃取條件，建立了一種大體積固相萃取結合高效液相色譜-串聯質譜測定水樣中五氯酚的方法。該方法具有靈敏度高、簡單、經濟和高效的特點，適用于地表水中五氯酚的檢測，為開發大體積水樣固相萃取的新方法提供了思路。