甜玉米芯多糖對胰島素抵抗HepG2細胞糖代謝功能的影響

馬永強，韓 燁，張 凱，王 鑫,*，王峙力

（1.哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076；2.哈爾濱工業大學生命科學與技術學院，黑龍江 哈爾濱 150080）

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一種流行性代謝疾病，在中國1.41億糖尿病患者中約占95%[1]，T2DM的發病及病程發展離不開胰島素抵抗，胰島素抵抗會引發胰島素代償性分泌、胰島β細胞負荷及功能衰竭，從而使代謝障礙人群發展為T2DM患者[2]。胰島素抵抗通常產生于肝臟、骨骼肌及脂肪細胞，其中肝臟作為人體糖脂代謝樞紐，在全身胰島素敏感性中都起到特殊作用[3]。

氧化應激是指線粒體產生過量活性氧（reactive oxygen species，ROS），并因此破壞核酸、蛋白質完整性，造成細胞損傷及凋亡的過程[4]。此外，ROS會增加促炎因子的表達，引起胰島素抵抗和肝臟糖代謝紊亂[5]。肝糖代謝紊亂是T2DM高血糖癥狀產生的原因之一。通常情況下，肝臟受到胰島素及胰高血糖素的調控（圖1[6]），通過糖原儲存、糖原消耗、糖酵解、糖異生等途徑調控血糖穩態[6]。研究表明，T2DM患者肝臟糖代謝酶表達異常[7]，葡萄糖生成途徑增強，葡萄糖消耗途徑減弱[6]。Krishnan等[8]的研究表明，促進糖酵解及糖原合成能夠顯著降低糖尿病大鼠血糖，事實上，長期處于高血糖狀態會損傷器官系統，引發糖尿病視網膜病變、糖尿病腎病等并發癥，降低患者血糖始終是T2DM治療的中心議題[9]。通過緩解氧化應激，改善肝臟攝取及轉化葡萄糖的功能，能夠有效緩解T2DM患者高血糖癥狀[10]。

圖1 胰腺-肝臟軸對葡萄糖穩態的調節[6]Fig.1 Pancreas-liver axis regulation of glucose homeostasis[6]

多糖是一種高分子碳水化合物，其作為生物體內重要的活性物質，在各項生命活動中都發揮不可替代的作用，目前被報道的天然活性多糖種類較多，其中馬尾藻多糖[11]、苦瓜堿提多糖[12]等均在體外HepG2細胞（人肝癌細胞）模型實驗中表現出調節細胞葡萄糖代謝、減輕胰島素抵抗的作用。

甜玉米芯即甜玉米（Zea maysL.saccharataSturt）脫粒后的穗軸，作為常見的農副產品，其利用途徑較為單一，多作為青貯飼料或焚毀，易造成資源浪費及環境污染[13]。在此前研究中，從甜玉米穗軸中分離的甜玉米芯多糖（sweet corncob polysaccharide，SCP）組分SCP-80-I在糖尿病模型動物實驗中呈現出劑量依賴的降糖效果，同時可改善胰腺組織形態，提升葡萄糖耐受程度[14]，考慮到胰島功能與肝臟功能的相互作用，本研究以胰島素抵抗HepG2（insulin resistant HepG2，IR-HepG2）細胞模型為研究對象，探討SCP-80-I對IR-HepG2細胞糖代謝功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肝癌HepG2細胞株購自American Type Culture Collection公司，由哈爾濱商業大學藥學院細胞與分子生物學研究所傳代保種。

甜玉米芯多糖（SCP-80-I）由哈爾濱商業大學食品工程學院自制；胰島素、噻唑藍（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）試劑盒 北京生物技術研究所；胎牛血清（fatal bovine serum，FBS），改良Eagle（Dulbecco’s modification of Eagle’s medium，DMEM）培養基、胰蛋白酶 武漢普諾賽生命科技有限公司；葡萄糖、總蛋白質、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、己糖激酶（hexokinase，HK）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）試劑盒 南京建城生物科技公司；ROS試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司；其他試劑為國產分析純。

1.2 儀器與設備

80-2型高速離心機 上海浦東物理光學儀器廠；ZLG-10型冷凍干燥機 寧肯夏亞康技術設備公司；TU-1900紫外-可見分光光度計、47組合式紫外檢測儀美國Nicolet公司；F-7000型熒光分光光度計 日本Hitachi公司；IX71倒置顯微鏡 奧林巴斯（中國）有限公司；NU-4750E型CO2培養箱 美國Nuaire公司；SX-500型高壓蒸汽滅菌器 日本Tomy公司。

1.3 方法

1.3.1 甜玉米芯多糖組分SCP-80-I的制備

以干燥甜玉米芯粉末為原料，參考文獻[15]制備多糖組分SCP-80-I：經熱水浸提、脫色、脫蛋白、醇沉、冷凍干燥等流程制備甜玉米芯粗多糖，后經DEAE-52纖維素柱層析及SephadexG-200葡聚糖凝交柱層析，分離多糖組分SCP-80-I。SCP-80-I純度97.2%，分子質量173.780 kDa，是一種由葡萄糖組成的均一多糖。

1.3.2 HepG2細胞的復蘇與傳代培養

HepG2細胞移入無菌培養瓶，懸浮均勻，加入5～8 mL含15% FBS的新鮮培養基，置于5% CO2孵育箱37 ℃培養（此后孵育條件相同）。24 h后棄去死亡細胞，Hanks液洗滌，以含有20% FBS的DMEM培養基孵育[16]。細胞貼壁80%后進行傳代培養，取對數生長期細胞用于后續實驗。

1.3.3 HepG2細胞胰島素抵抗模型建立

HepG2細胞經質量分數0.25%胰蛋白酶溶液消化，用DEME培養基調節密度至104個/mL，接種于96 孔板（100 μL/孔）。待細胞單層黏附后，加入不同作用濃度的胰島素（0、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8mol/L）孵育24 h，其中以不含胰島素為空白組，按照葡萄糖含量測定試劑盒說明書測定各組葡萄糖消耗量，并按式（1）計算葡萄糖消耗減少率，確定HepG2細胞胰島素抵抗模型中的胰島素濃度；然后加入一定濃度的胰島素培養不同時間（12、24、36、48 h）[17]，測定各組葡萄糖消耗量，按式（1）計算葡萄糖消耗減少率，根據葡萄糖含量變化選擇誘導IR-HepG2模型的最佳作用時間，以最佳條件建立IR-HepG2細胞模型。

式中：c空白組為空白組葡萄糖消耗量/（mmol/L）；c胰島素為相同孵育時間對應濃度胰島素與HepG2細胞孵育后的葡萄糖消耗量/（mmol/L）。

1.3.4 細胞葡萄糖消耗實驗

將HepG2細胞隨機分為6 組（表1），孵育24 h后，測定各組葡萄糖消耗量。

表1 HepG2細胞的葡萄糖消耗分組Table 1 Grouping of glucose uptake in HepG2 cells

IR-HepG2細胞的葡萄糖消耗情況分組如表2所示，孵育24 h后，測定各組葡萄糖消耗量。

表2 IR-HepG2細胞的葡萄糖消耗分組Table 2 Grouping of glucose uptake in IR HepG2 cells

1.3.5 MTT法測定細胞活力

利用MTT法檢測細胞相對活力，此方法通過活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原MTT顯色，常用于細胞增殖及細胞毒性實驗[18]，實驗分組同1.3.4節，各組加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，搖勻至紫色晶體溶解，測定490 nm波長處OD值，計為MTT值（OD490nm），用以表示細胞活力。并按式（2）計算單位細胞葡萄糖消耗量（ΔGC/MTT）。

式中：ΔGC為葡萄糖消耗量/（mmol/L）。

1.3.6 氧化應激標志物水平測定

實驗分組同1.3.4節表2中模型對照組、陽性對照組和SCP200組，以表1中空白對照組為空白對照，根據MDA和SOD試劑盒說明書測定IR-HepG2細胞中MDA、SOD的水平[19]。采用二氯熒光素雙醋酸鹽熒光探針法試劑盒測定細胞中ROS水平，測定結果以空白對照組為比較基準。

1.3.7 糖原含量測定

1.3.8 糖酵解限速酶活力測定

實驗分組同1.3.6節。采用蛋白濃度測定試劑盒測定細胞蛋白質量濃度。采用HK、PK試劑盒對HK和PK的活力進行測定。

1.4 數據統計與分析

所有實驗數據均以平均值±標準差表示，使用SPSS 17.0統計軟件進行顯著性分析（使用單因素方差分析中的Tukey檢驗），P＜0.05代表差異顯著，P＜0.01代表差異極顯著，用Origin軟件繪制相關圖表。

2 結果與分析

2.1 建立IR-HepG2細胞模型

胰島素抵抗是T2DM的典型特征之一[2]。為評價SCP-80-I的對肝臟糖代謝的影響，實驗建立IR-HepG2細胞模型，以細胞葡萄糖消耗能力為胰島素抵抗程度的評價指標。

如圖2A所示，在1×10-8～1×10-5mol/L濃度的胰島素作用下，HepG2細胞的葡萄糖消耗量均低于空白組，整體呈先下降后上升的趨勢[20]，其中胰島素濃度為1×10-5mol/L與1×10-6mol/L組與空白組差異顯著（P＜0.05）；由圖2B可知，在1×10-8～1×10-5mol/L濃度的胰島素作用下，HepG2細胞的葡萄糖消耗量分別減少9.4%、14.5%、28.2%、21.5%，其中胰島素濃度為1×10-6mol/L時，葡萄糖消耗減少率達到最高值，表明在該濃度下誘導的HepG2細胞胰島素抵抗程度最高，故選擇此濃度進行后續實驗。

圖2 不同濃度胰島素對HepG2細胞葡萄糖消耗的影響（n＝6）Fig.2 Effect of different concentrations of insulin on glucose consumption (n = 6)

如圖3A所示，在1×10-6mol/L的胰島素條件下培養HepG2細胞12、24、36、48 h時，HepG2細胞的葡萄糖消耗量均有所上升，與前人研究結果[21]類似，其中作用時間為12 h與24 h組與空白組差異極顯著（P＜0.01）；由圖3B可知，與空白組相比，HepG2細胞在12、24、36、48 h時葡萄糖消耗量分別減少27.6%、37.8%、11.1%和8.2%，在作用時間為24 h時，葡萄糖消耗減少率達到最高值37.8%，表明該作用時間誘導的HepG2細胞胰島素抵抗程度最高。最終選擇以1×10-6mol/L胰島素處理24 h誘導形成IR-HepG2細胞。

圖3 不同作用時間對葡萄糖消耗的影響（n＝6）Fig.3 Effect of insulin treatment time on glucose consumption (n = 6)

2.2 SCP-80-I對細胞葡萄糖消耗的影響

利用不同質量濃度（50、100、200、400 μg/mL）的SCP-80-I和二甲雙胍（100 μg/mL）分別干預正常HepG2細胞和IR-HepG2模型細胞24 h，細胞葡萄糖消耗量結果如圖4所示。

圖4 SCP-80-I對細胞葡萄糖消耗量的影響（n＝3）Fig.4 Effect of SCP-80-I on glucose consumption in cells (n = 3)

如圖4A所示，隨著SCP-80-I作用濃度增加，HepG2細胞葡萄糖消耗量呈先增加后減少的趨勢，在100 μg/mL時達到最高，為（2.45±0.07）mmol/L。50～200 μg/mL質量濃度的SCP-80-I組與空白對照組比較無顯著差異（P＞0.05），而經400 μg/mL SCP-80-I作用后，HepG2細胞的葡萄糖消耗量極顯著下降（P＜0.01），可能的原因為高質量濃度的SCP-80-I抑制了HepG2細胞的活性[22]。

在37℃，72 h培養時間條件下，研究不同接種量對酯化力的影響，實驗結果見圖5。由圖5可知，隨著接種量的增加，酯化力先增高后降低。接種量為1%時，發酵產物的酯化力較低。當接種量為2%時，麩曲的酯化力最高，與1%接種量的發酵產物相比有了明顯的提高。之后增大菌種的接種量，發酵產物的酯化力沒有明顯的提高。

如圖4B所示，陽性對照組與SCP各組均提高IR-HepG2細胞葡萄糖消耗量，隨著SCP-80-I質量濃度增加，IR-HepG2細胞葡萄糖消耗量呈先增加后減少的趨勢，在200 μg/mL時達到最高，為（5.49±0.08）mmol/L，SCP-80-I各組與模型對照組均有顯著性差異（P＜0.05）。

2.3 SCP-80-I對細胞活力的影響

如圖5A所示，隨著SCP-80-I質量濃度的增加，HepG2細胞活力逐漸降低，SCP-80-I質量濃度為50、100 μg/mL時，細胞活力與空白對照組比較無顯著性差異（P＞0.05），質量濃度為200、400 μg/mL時，細胞活力與空白對照組相比顯著下降（P＜0.01），結果表明高質量濃度的SCP-80-I對正常HepG2細胞的生長和繁殖有抑制作用，在之前的研究中，青錢柳多糖[22]、樺褐孔菌多糖[23]在HepG2細胞實驗中均表現出相似特性。

圖5 SCP-80-I對細胞活力的影響（n＝3）Fig.5 Effect of SCP-80-I on cell viability (n = 3)

如圖5B所示，IR-HepG2細胞活力與空白對照組相比極顯著降低（P＜0.01），陽性藥物二甲雙胍與SCP-80-I均提高了IR-HepG2細胞活力，隨著SCP-80-I質量濃度的增加，IR-HepG2細胞的細胞活力呈先上升后下降的趨勢，在200 μg/mL時達到最高（0.505±0.001），與模型對照組相比增加了15.5%（P＜0.01）。

如圖6A所示，隨著SCP-80-I質量濃度的增加，HepG2細胞的ΔGC/MTT呈先上升后下降的趨勢，在200 μg/mL時達到最高，為（6.62±0.55）mmol/L，與空白對照組相比極顯著增加了16.5%（P＜0.01）。

圖6 SCP-80-I對單位細胞葡萄糖消耗量的影響（n＝3）Fig.6 Effect of SCP-80-I on glucose consumption of cells (n = 3)

如圖6B所示，模型對照組細胞的單位葡萄糖消耗量極顯著低于空白對照組（P＜0.01），經陽性藥物二甲雙胍或SCP-80-I作用后均升高，隨著SCP-80-I質量濃度的增加，IR-HepG2細胞的ΔGC/MTT呈先上升后下降的趨勢，在200 μg/mL時達到最高，為（10.86±0.02）mmol/L，與模型對照組相比極顯著增加了11.2%（P＜0.01）。結果提示SCP-80-I可促進HepG2細胞及IR-HepG2細胞的葡萄糖攝取，呈現一定的量效關系，但考慮到高濃度SCP-80-I對正常HepG2細胞的活力有一定抑制作用，選擇質量濃度為200 μg/mL的SCP-80-I進行后續實驗。

2.4 SCP-80-I對IR-HepG2細胞氧化應激的影響

T2DM患者體內存在不同程度的抗氧化系統失調，抑制氧化應激可作為降血糖和延緩糖尿病并發癥的輔助治療手段[24]。SOD活力與MDA含量是評價機體抗氧化能力的常用標志物，前者可降低自由基毒性，保護細胞免受氧化應激損傷，后者則作為脂質過氧化的終產物，可致生物膜變性、激活凋亡進程[19]，實驗通過二者的變化，評價SCP-80-I對IR-HepG2細胞氧化應激的影響。

如表3所示，與空白對照組正常HepG2細胞相比，模型對照組IR-HepG2細胞的MDA含量極顯著升高，SOD活力極顯著降低（P＜0.01），ROS含量極顯著升高（P＜0.01），表明其抗氧化能力下降，氧化應激程度升高；經質量濃度為200 μg/mL的SCP-80-I作用24 h后，細胞MDA含量下降41.69%，SOD活力增加31.79%，與模型對照組相比有極顯著差異（P＜0.01），與陽性對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。與模型對照組相比，SCP200組ROS水平下降20.83%（P＜0.01），提示SCP-80-I可增強IR-HepG2細胞抗氧化能力，對氧化應激細胞有潛在的保護作用。

表3 SCP-80-I對IR-HepG2細胞SOD活力、MDA含量和ROS水平的影響（n＝3）Table 3 Effect of SCP-80-I on SOD activity, MDA content and ROS level of IR-HepG2 cells (n = 3)

2.5 SCP-80-I對IR-HepG2細胞糖代謝的影響

人體內葡萄糖以糖原的形式儲存，其主要存在于肝臟和肌肉，是血糖的重要來源[25]。HK是糖酵解途徑的關鍵限速酶[26]。其激活可增加胰島素釋放和肝臟葡萄糖利用率，加速葡萄糖分解代謝，降低血糖水平；另一個控制糖酵解過程的限速酶是PK，其主要功能是將磷酸烯醇丙酮酸和ADP轉化為ATP及丙酮酸，同樣在肝臟葡萄糖攝取和血糖調控方面起到重要作用[26]。本實驗通過細胞糖原水平及HK、PK活力變化，評價SCP-80-I對IR-HepG2細胞糖代謝功能的影響。

如表4所示，與空白對照組正常-HepG2細胞相比，IR-HepG2細胞的糖原含量極顯著降低（P＜0.01）。經質量濃度為200 μg/mL的SCP-80-I作用后，細胞糖原含量增加了25.13%，極顯著高于模型對照組（P＜0.01）。

表4 SCP-80-I對IR-HepG2細胞糖代謝的影響（n＝3）Table 4 Effect of SCP-80-I on glucose metabolism in IR HepG2 cells (n = 3)

與空白對照組正常HepG2細胞相比，IR-HepG2細胞的HK、PK活力極顯著降低（P＜0.01）。而與模型對照組相比，陽性對照組HK、PK活力極顯著增加（P＜0.01）。經質量濃度為200 μg/mL的SCP-80-I作用后，細胞內HK活力增加21.39%，PK活力增加29.55%，極顯著高于模型對照組（P＜0.01）。類似的，Liu Wei等[27]發現草珊瑚多糖具有增強HK、PK活性，可調節肝糖代謝。結果提示SCP-80-I可通過促進肝糖原合成和糖酵解，提高肝臟對葡萄糖的攝取利用，從而達到降低血糖的目的。

3 討 論

胰腺-肝臟軸在T2DM患者體內呈現特有模式[6]，肝靶向抗糖尿病藥物，如葡萄糖激酶（glucokinase，GK）激活劑、糖原磷酸化酶（glycogen phosphorylase，GP）抑制劑等，是較為新穎的治療策略，可作用于肝臟，通過影響糖酵解、糖異生等途徑，調控糖尿病患者血糖水平[28]。人肝癌HepG2細胞的胰島素抵抗模型常用于研究降糖物質對肝功能的影響，Xu Tuo等[29]證明枸杞多糖可顯著增加IR-HepG2細胞的葡萄糖消耗，增強細胞胰島素敏感性。張易等[12]制備的苦瓜堿提多糖可促進IR-HepG2細胞的葡萄糖及脂質代謝。在本研究中，從甜玉米芯中提取純化的多糖組分SCP-80-I可顯著增加IR-HepG2細胞葡萄糖消耗，使其接近正常HepG2細胞水平（P＞0.05），且呈現一定的量效關系；MTT實驗及數據分析結果顯示高濃度的SCP-80-I對細胞生長增殖有抑制作用，但整體仍表現對葡萄糖消耗的促進作用，在SCP-80-I質量濃度為200 μg/mL時，IR-HepG2細胞的活力及單位細胞葡萄糖消耗量達到最高。

氧化應激是導致T2DM發病及發展的最關鍵因素[30]。MDA等標志物用于評價機體氧化應激程度[31]。在本研究中，質量濃度為200 μg/mL的SCP-80-I極顯著降低IR-HepG2細胞內MDA含量（P＜0.01），增加SOD活力（P＜0.01），減少ROS產生（P＜0.01），增強細胞抗氧化能力。

事實上，氧化應激進程與內質網應激、代謝性炎癥關系密切，不僅影響胰島β細胞胰島素分泌[32]，同時也加重肝臟糖代謝功能失調[33]，造成包括糖原的易分解性[34]及合成減少、糖酵解抑制、糖異生增加[35]。增強糖原合成是消耗葡萄糖的有效方式[36]，Ma Xiaolei等[25]發現灰樹花多糖可促進IR-HepG2細胞糖原合成，促進葡萄糖代謝。此外，在糖酵解途徑中的兩個限速酶，PK和HK活性的恢復可提高肝臟葡萄糖利用率。在Oyedemi等[37]的研究中，槲皮素增強果糖聯合鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導的糖尿病大鼠肝臟HK活性，增強大鼠糖耐量，降低空腹血糖濃度。Wang Kaiping等[26]證明鐵皮石斛多糖可顯著提高STZ誘導的T2DM小鼠肝臟PK和HK等葡萄糖代謝酶的活性，通過促進糖原合成和調節糖代謝進程來改善高血糖癥狀。在本研究中，與模型對照組相比，質量濃度為200 μg/mL的SCP-80-I能夠極顯著提高IR-HepG2細胞糖原含量（P＜0.01），分別將糖酵解關鍵酶HK、PK的活力極顯著地提高了21.39%和29.55%（P＜0.01），提示其可增強肝臟對循環葡萄糖的攝取、儲存及分解利用。

綜上所述，甜玉米芯多糖SCP-80-I可通過緩解氧化應激造成的細胞損傷，對肝臟糖代謝功能起到正面影響，先前研究表明，多糖的降血糖作用可同時通過多條體內途徑起效[38]，SCP-80-I在先前的體內實驗[14]和本研究（體外實驗）中均表現出對胰腺及肝臟的保護作用[14]，從而起到穩定的降糖效果。本研究可為甜玉米芯多糖在健康食品、藥品領域的應用提供理論依據，為農業副產品的高值化利用提供參考。