中華鱘B細胞活化因子的分子表征及與免疫反應相關的潛在功能

夏翱文 劉榴 李小花 聶東宋 廖志勇

摘要 [目的]探究中華鱘B細胞活化因子（CsBAFF）的分子表征及其與免疫反應相關的潛在功能。[方法]通過免疫刺激后獲得中華鱘各組織。結(jié)合生物信息學分析，構(gòu)建和篩選CsBAFF的cDNA文庫，并采用定量RT-PCR進行驗證分析。采用分子生物學的方法進行CsBAFF的質(zhì)粒構(gòu)建及重組sCsBAFF的制備。采用MTT試驗檢測細胞的增殖，以及結(jié)合免疫印跡分析相關蛋白的表達。[結(jié)果]克隆了CsBAFF的cDNA，包含765個核苷酸的開放閱讀框，編碼255個氨基酸，分子量為28.9 kD。CsBAFF具有跨膜結(jié)構(gòu)域、TNF結(jié)構(gòu)域、furin蛋白酶裂解位點、長D-E環(huán)、1個潛在的N-連接糖基化位點和2個保守的半胱氨酸殘基。CsBAFF基因主要表達于頭腎和脾臟，且三價滅活疫苗和聚肌苷酸均能誘導CsBAFF基因表達。重組CsBAFF能促進中華鱘和小鼠淋巴細胞的增殖，其中保守的半胱氨酸殘基Cys201和Cys214是CsBAFF發(fā)揮生理功能必不可少的位點。[結(jié)論]B細胞活化因子（BAFF）是腫瘤壞死因子（TNF）家族成員之一，在B淋巴細胞的增殖、存活、分化和成熟過程中起著重要作用。

關鍵詞 中華鱘;B細胞活化因子;免疫應答

中圖分類號 S 917.4? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）18-0105-08

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.18.026

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Molecular Characterization of B Cell-Activating Factor from Chinese Sturgeon （Acipenser Sinensis） and Its Potential Function Related to Immune Response

XIA Ao-wen，LIU Liu，LI Xiao-hua et al （College of Life and Environmental Science，Wenzhou University，Wenzhou，Zhejiang 325035）

Abstract [Objective] To explore the molecular characterization of Chinese sturgeon B cell activating factor （CsBAFF） and its potential functions related to immune response.[Method]Various tissues of Chinese sturgeon were obtained after immune stimulation.Combined with bioinformatics analysis，a cDNA library of CsBAFF was constructed and screened，and quantitative RT-PCR was used for verification and analysis.Using molecular biology methods，the plasmid construction of CsBAFF and the preparation of recombinant sCsBAFF were carried out.The MTT experiment was used to detect cell proliferation，and the expression of related proteins was analyzed in combination with western blotting.[Result]In this study，the cDNA of CsBAFF was cloned.It contains an open reading frame of 765 nucleotides，encodes 255 amino acids，and has a molecular weight of 28.9 kDa.CsBAFF has a transmembrane domain，a TNF domain，a furin protease cleavage site，a long D-E loop，a potential N-linked glycosylation site and two conserved cysteine residues.CsBAFF gene is mainly expressed in head kidney and spleen，and both trivalent inactivated vaccine and polyinosinic acid can induce CsBAFF gene expression.Recombinant CsBAFF can promote the proliferation of Chinese sturgeon and mouse lymphocytes，and the conservative cysteine residues Cys201 and Cys214 are essential sites for CsBAFF to exert its physiological functions.[Conclusion]B cell activating factor （BAFF） is a member of the tumor necrosis factor （TNF） family，which plays an important role in the proliferation，survival，differentiation and maturation of B lymphocytes.

Key words Chinese sturgeon;B-cell activating factor;Immune response

基金項目 中國國家基礎研究項目（2013CB835301）。

作者簡介 夏翱文（1997—），女，河南周口人，碩士研究生，研究方向：活性大分子化學生物學。*通信作者，教授，博士，碩士生導師，從事腫瘤免疫與分子生物學研究。

鳴? 謝 中科院生物化學與細胞生物學研究所劉曉龍教授和浙江大學徐平龍教授提出寶貴建議。

收稿日期 2021-01-21

TNF超家族成員在免疫系統(tǒng)發(fā)育和功能中起著重要作用。其中，B細胞活化因子（BAFF，又稱TNFSF13b，BLyS，TALL-1和zTNF4），主要由中性粒細胞、單核細胞、樹突狀細胞（DC）和活化T細胞等免疫細胞產(chǎn)生[1-3]，對調(diào)節(jié)淋巴細胞的活化和存活尤其重要[4-5]。脊椎動物中的BAFF蛋白包含1個跨膜結(jié)構(gòu)域和3個保守的半胱氨酸殘基，并且在C端細胞外結(jié)構(gòu)域中的furin蛋白酶共有位點進行蛋白水解加工時，可以以膜結(jié)合形式或作為可溶性三聚體配體起作用[6-7]。與其他TNF家族相比，BAFF的晶體結(jié)構(gòu)分析表明，BAFF具有異常長的D-E環(huán)（“ Flap”），該環(huán)的形成可能是受體結(jié)合和類病毒組裝過程中潛在的重要區(qū)域[8-9]。

BAFF參與先天和適應性免疫反應的調(diào)節(jié)過程。在哺乳動物中，BAFF在B細胞增殖、分化和存活中起著至關重要的作用[10-12]，并且BAFF具有與3種受體結(jié)合的功能，即形成B細胞成熟抗原（BCMA）、跨膜激活劑和親環(huán)蛋白配體相互作用物（TACI）和BAFF受體（BAFF-R或BR3）[13-14]。BAFF-R是與BAFF結(jié)合的特殊受體[14]，而TACI和BCMA也與增殖誘導配體（APRIL）相互作用，后者是另一種TNF家族成員，其細胞外結(jié)構(gòu)域與BAFF具有33%的統(tǒng)一性[15]。 BAFF-R和BCMA僅在B細胞上表達，而TACI主要在B細胞和活化的T細胞上表達[16-17]。研究表明，BAFF與BAFF-R的結(jié)合介導了B細胞的存活并增強了體液免疫反應，BAFF與BCMA的結(jié)合對于長期的漿細胞生物學和抗原呈遞很重要，而BAFF與TACI的結(jié)合可能會對NF-κB和NFAT信號通路產(chǎn)生負調(diào)控[18-19]。 BAFF表達失調(diào)可能會導致自身免疫性疾病，例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風濕關節(jié)炎[20-21]。

有關研究顯示，在不同的硬骨魚[22-30]和軟骨魚[31]中鑒定了BAFF的 cDNA序列。但是，對于中華鱘中BAFF特征和功能知之甚少。中華鱘（Acipenser sinensis）是最原始的物種之一，因其維持軟骨魚類和硬骨魚類之間的進化特征而被稱為水生生物化石。由于中華鱘長期遭到過度捕撈，產(chǎn)卵地破壞及其他人為干擾的威脅，被列為國家一級保護動物[32]。為了進一步了解中華鱘中的BAFF分子進化和免疫應答的調(diào)控，筆者進行了中華鱘中的BAFF分子克隆、系統(tǒng)發(fā)育分析、表達和生物活性的分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原材料。中華鱘，購自中華鱘繁殖基地，重（315±30） g。小鼠淋巴細胞（RAW264.7），購自中國科學院上海生物科學研究所細胞資源中心。

1.1.2 主要試劑。感受態(tài)細胞、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;cDNA文庫構(gòu)建試劑盒，購自美國Clontech有限公司;MTT試劑盒、Trizol試劑盒、脫脂奶粉、SDS-PAGE凝膠試劑盒、滅菌DEPC水、PVDF膜、RIPA裂解液、小鼠抗His抗體，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;細胞培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶、無菌PBS，購自美國Gbico生物技術(shù)公司;快速定點誘變試劑盒，購自美國Stratagene公司;RNA吸附柱、卡納/氨芐霉素、無水乙醇，購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 主要儀器。高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠;超凈工作臺，蘇州市潔新空調(diào)凈化設備有限公司;水平脫色搖床，江蘇海門其林貝爾儀器公司;多功能酶標儀，美國BioTek公司;細胞培養(yǎng)箱，松下健康醫(yī)療器械株式會社;烘箱，上海龍躍儀器設備有限公司;熒光定量PCR儀，瑞士Roche公司;恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫刺激。參考文獻[33]，將魚隨機分組（每組5只），并通過腹膜內(nèi)注射200 μL溶于PBS的1.0 mg/mL多肌苷酸聚胞苷酸（ploy（I∶C））（GE，美國）刺激，或用200 μL滅活3價細菌疫苗鰻弧菌（1.0×108集落形成單位/mL），該疫苗是根據(jù)前人報道的方法制備[34]。以注射無菌PBS的中華鱘作為對照。在免疫刺激后的預設時間內(nèi)，從中華鱘（每個時間點5條魚）中解剖出包括頭腎、脾、心臟、腸，腦和肝在內(nèi)的組織，并立即儲存于液氮中，以進行RNA提取和實時定量RT -PCR分析。

1.2.2 cDNA文庫的構(gòu)建和篩選。按照試劑的使用說明，從中華鱘脾臟中分離總RNA，構(gòu)建中華鱘脾臟的cDNA文庫，將所有大于500 bp的cDNA片段插入pDNR-LIB載體，然后轉(zhuǎn)化到DH10B感受態(tài)細胞。隨機挑選cDNA克隆，在37 ℃下培養(yǎng)過夜，提取含有各種cDNA的質(zhì)粒。使用T7引物在自動ABI Prism 3730測序儀中對每個cDNA進行5′端測序。

1.2.3 生物信息學分析。使用美國國家生物技術(shù)信息中心的BLAST程序分析了中華鱘BAFF（CsBAFF）的cDNA和氨基酸序列（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/），以及CsBAFF的多序列比對使用BioEdit軟件執(zhí)行。使用簡單的模塊化體系結(jié)構(gòu)研究工具SMART 4.0版（http：//www.Smart.Emblheidelberg.de/）預測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。預測的furin蛋白酶切割位點用ProP 1.0 Server進行鑒定（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ProP/）。系統(tǒng)發(fā)育樹是使用MEGA 7.0版[35]構(gòu)建的。

1.2.4 定量RT-PCR分析。按照試劑的使用說明，從實驗中華鱘的各種組織中提取總RNA，并用不含RNase的DNase I處理。反轉(zhuǎn)錄后，設置 RT-PCR反應程序為50 ℃，30 min;94 ℃，5 min;94 ℃，20 s，30個循環(huán);60 ℃，20 s;72 ℃，20 s。在每次PCR結(jié)束時進行擴增產(chǎn)物的熔解曲線分析，以確認僅擴增了一種特異性PCR產(chǎn)物。使用比較閾值循環(huán)法（Δct），以β-肌動蛋白作為內(nèi)部對照，分析CsBAFF表達水平。每個RNA樣品重復3次進行qRT-PCR測定。引物序列詳見表1。

1.2.5 質(zhì)粒構(gòu)建。使用表1中列出的引物，通過PCR擴增CsBAFF的細胞外片段（可溶性CsBAFF，sCsBAFF）的編碼序列。PCR產(chǎn)物用Xho I和EcoR V酶消化，并插入到pRSET-α-His載體中以分別構(gòu)建pRSET-α-His-sCsBAFF質(zhì)粒。使用快速定點誘變試劑盒將Cys201和Cys210（表1）突變?yōu)锳la。所有序列均經(jīng)生工生物工程（上海）股份有限公司測序驗證。

1.2.6 重組sCsBAFF的制備。用His標簽的野生型或突變的sCsBAFF質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌。在LB培養(yǎng)基中于37 ℃下生長至OD600為0.8，然后在25 ℃下用1 mmol/L異丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）誘導12 h。通過以10 000 r/min 離心5 min沉淀細胞，然后在4 ℃的裂解緩沖液（10 mmol/L NaH2PO4、10 mmol/L Tris，1%Triton X-100、0.1 mmol/L PMSF，pH 8.0）中進行超聲處理。通過以10 000 r/min 離心30 min去除細胞碎片，并使用Ni-NTA樹脂純化重組蛋白。通過在4 ℃的PBS中透析過夜，使純化的重組蛋白復性。將純化的蛋白質(zhì)去除內(nèi)毒素，并將蛋白質(zhì)濃縮，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，然后使用小鼠抗His抗體進行蛋白質(zhì)印跡分析。

1.2.7 細胞培養(yǎng)。使用淋巴細胞分離培養(yǎng)基從脾臟勻漿中分離中華鱘脾細胞。制備的脾細胞在25 ℃的DMEM中培養(yǎng)，DMEM中添加了10%胎牛血清，1%谷氨酰胺和1%青霉素/鏈霉素。將小鼠淋巴細胞（RAW264.7）在37 ℃的CO 2培養(yǎng)箱中及添加有10%FBS、100 μg/mL青霉素/鏈霉素的DMEM中培養(yǎng)。

1.2.8 免疫印跡分析。純化的重組sCsBAFF蛋白通過10%非變性SDS-PAGE分離，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將膜與小鼠抗His抗體在4 ℃孵育過夜。洗滌3遍后，加入與辣根過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠抗體，并在37 ℃下孵育1 h。將膜洗滌3遍，然后檢測化學發(fā)光增強的蛋白質(zhì)。

1.2.9 MTT 試驗。參考文獻[36]，測定中華鱘脾細胞和小鼠淋巴細胞在不同刺激條件下的存活率。使細胞（96孔板中每孔105個細胞）在200 μL培養(yǎng)基中生長，并分別用重組野生型或突變的sCsBAFF蛋白處理48 h。向每個孔中加入20 μL MTT（5 mg/mL），反應4 h。以1 000 r/min離心10 min后，除去上清液，然后向每孔中加入150 μL DMSO。使用酶標儀在570 nm下測量光密度（OD）值。

1.2.10 數(shù)據(jù)分析。通過單向方差分析進行數(shù)據(jù)分析，使用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。在P<0.05水平考慮具有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsBAFF 的cDNA分析 BAFF作為一種TNF樣的細胞因子，對于B淋巴細胞的存活和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關重要[37]。通過對中華鱘脾臟的cDNA庫進行測序，分離了CsBAFF的全長cDNA克隆（GenBank登錄號MH753007）。該cDNA包含1個30 bp的5′-非翻譯末端區(qū)域（5′-UTR），1個768 bp的開放閱讀框和1個845 bp的3′-UTR，其中存在5個潛在的mRNA不穩(wěn)定基序（ATTTA或ATTTTA）和2個聚腺苷酸化信號（AATAAA），最后1個5 bp位于聚（A）尾巴的上游（圖1）。這些序列特征都表明獲得了全長cDNA。推導的CsBAFF具有255個氨基酸殘基，分子量為28.9 kD。哺乳動物BAFF是一種II型跨膜蛋白，在特征序列基序內(nèi)由furin蛋白酶加工而成，從而釋放了具有生物活性的可溶性BAFF蛋白[38]。 CsBAFF的細胞外存在一個與預測的跨膜結(jié)構(gòu)域（殘基15-37）接近的furin蛋白酶切割位點（RTRR），這表明CsBAFF可能以類似于哺乳動物BAFF的方式進行加工。特別是CsBAFF具有保守的長D-E環(huán)（稱為“ Flap”），這是TNF家族中BAFF獨有的[39]。D-E環(huán)特異性參與形成BAFF的60聚體復合物，以通過與B細胞上的適當受體結(jié)合來實現(xiàn)其生物學活性[19]，這表明CsBAFF可能以多聚體形式發(fā)揮作用。并且確定了潛在的N-糖基化位點67NPT69，表明CsBAFF可能需要翻譯后的糖基化修飾。

2.2 CsBAFF的系統(tǒng)發(fā)育樹及生物信息學分析

BLAST分析表明，CsAFF在氨基酸序列水平上與魚BAFF具有顯著同源性，與魚BAFF同源物具有最高的序列同一性，為56.1%（表2）。不同BAFF分子的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）表明，所選BAFF蛋白可以分為5個主要的明確定義的簇，其中CsBAFF與魚類BAFF一起簇集。哺乳動物、鳥類、爬行動物、兩棲動物和魚類BAFF之間不同程度的差異可能反映它們的系統(tǒng)發(fā)育差異。

CsBAFF與其他脊椎動物BAFF的多序列比對顯示了BAFF的比對氨基酸序列之間的差異（圖3A），即使對于可能與BAFF的結(jié)構(gòu)和功能潛在相關的關鍵殘基也是如此。例如，一個D/E殘基（紅色）由于其負電荷而被認為對受體結(jié)合很重要[40]，但在對齊的BAFF中并沒有那么保守。盡管在整個比對的BAFF中有2個保守Cys殘基，但僅在CsBAFF和軟骨魚BAFF中缺失了另一個Cys殘基（圖3A），考慮到這些保守的Cys，其重要性仍有待研究。BAFF C末端的殘基可以在BAFF受體與BAFF三聚體中的每個單體配體之間形成連接[40-41]。盡管在氨基酸水平上存在差異，但是sCsBAFF單體的3D預測結(jié)構(gòu)與人類的非常相似，并且重要的結(jié)構(gòu)氨基酸在相同的空間位置上保守（圖3B），進一步表明CsBAFF可能具有與哺乳動物BAFF相似的體內(nèi)生物學功能。

2.3? CsBAFF 對免疫刺激的反應

使用實時定量RT-PCR檢測CsBAFF mRNA在各種組織中的表達（圖4）。結(jié)果顯示，CsBAFF在脾臟、頭腎和腸中高表達（P <0.05），而在心臟中的表達很低。據(jù)報道，哺乳動物的BAFF基因主要在單核/巨噬細胞和樹突狀細胞中表達[4]。研究表明，魚類中BAFF基因通常在脾臟和腎臟中以最高水平表達，如日本海鱸[22]和魚中[29]，而其他魚類中的BAFF基因則以普遍存在的方式表達，如日本的草魚[23]和大黃魚[24]。硬骨魚的頭部、腎臟和脾臟是淋巴器官，是分化粒細胞、B細胞、T細胞、單核細胞和自然殺傷細胞的主要部位[42-43]。這些器官通過激活淋巴細胞來啟動適應性免疫反應，被認為是先天性和適應性免疫反應的主要部位。因此，CsBAFF的組織分布提示CsBAFF參與免疫應答。

為了進一步研究CsBAFF對微生物病原體感染的潛在免疫反應，用滅活的3價細菌疫苗鰻弧菌和被認為是雙鏈RNA合成類似物的聚肌胞苷酸（Poly A∶C）處理了中華鱘。

在免疫激發(fā)后的不同時間段分析了CsBAFF基因在頭腎、腸、肝和脾中的表達模式。免疫激發(fā)后以組織特異性方式顯著誘導CsBAFF表達（圖5、6）。結(jié)果顯示，響應于2種免疫刺激，頭腎、脾臟和腸中的CsBAFF mRNA差異性表達，并在免疫刺激后72 h達到最高水平，但在肝臟中均不顯著上調(diào)。與對照相比（圖5），疫苗誘導的mRNA表達水平在脾臟中分別增加了750%（P<0.05），在頭腎中增加了550%（P<0.05），在腸中增加了390%（P<0.05）。由圖6可知，由poly（I∶C）誘導的CsBAFF mRNA表達在脾臟中增加了480%（P<0.05），在頭腎中增加了730%（P<0.05），在腸中增加了170%（P<0.05）。在達到最高水平后，誘導的CsBAFF mRNA表達隨后下降。在該研究中，細菌和病毒感染導致CsBAFF表達增加的發(fā)現(xiàn)表明，CsBAFF是多種病原體的重要免疫基因，在對病原體入侵的免疫反應中起著與哺乳動物BAFF類似的作用[44]。

2.4 sCsBAFF 刺激淋巴細胞增殖

BAFF是一種II型膜蛋白，可以通過furin蛋白酶在細胞表面形成可溶形式。多聚體形式的細胞外片段（可溶性BAFF）具有與膜結(jié)合BAFF相似的生物學活性[1-2]。為了研究CsBAFF蛋白的活性，筆者用pET28a質(zhì)粒在大腸桿菌中表達了CsBAFF（sCsBAFF）的可溶性成熟部分。純化的sCsBAFF蛋白質(zhì)印跡分析顯示，在未變性的條件下，在約22 kD處有一條明顯的條帶（單體形式的sCsBAFF），但純化的sCsBAFF變性后出現(xiàn)了多聚sCsBAFF的條帶（圖7A），表明成功制備了sCsBAFF可溶性形式的重組sCsBAFF蛋白。用未變性或變性的sCsBAFF處理從中華鱘和小鼠脾臟B細胞中分離出的脾淋巴細胞。結(jié)果顯示，與對照培養(yǎng)物相比，經(jīng)sCsBAFF處理的中華鱘脾淋巴細胞的絕對數(shù)量要多于對照培養(yǎng)物（圖7B），在經(jīng)過重組sCsBAFF處理的小鼠脾臟B細胞培養(yǎng)物中也可發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果（圖7C）。但是，未變性的sCsBAFF對這些淋巴細胞的增殖沒有明顯的影響（圖7B、圖7C）。因此可以得出結(jié)論，sCsBAFF可能會提高存活率或誘導脾臟B細胞的選擇性增殖。這些發(fā)現(xiàn)與先前的研究吻合，表明BAFF-BAFFR相互作用對于脾臟B細胞的存活和成熟必不可少[45]。另外，該同時突變了CsBAFF中的Cys201和Cys214殘基，其在所有比對的BAFF分子中高度保守。出乎意料的是，甚至在復性后也幾乎沒有多聚sCsBAFF帶（圖7A）。因此，變性或未變性的sCsBAFF都不會刺激中華鱘脾臟淋巴細胞和小鼠脾臟B細胞的增殖（圖7B、圖7C）。這些結(jié)果進一步證明，sCsBAFF主要以多聚體的形式起作用，并證明了2個保守的半胱氨酸殘基在BAFF功能中具有重要作用。

3 結(jié)論

該研究克隆了中華鱘 BAFF的全長cDNA，根據(jù)該序列分析了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，證明了其在正常組織中的表達以及對細菌和病毒感染的抵抗力，并研究了其在體外促進淋巴細胞增殖的生物活性。該研究結(jié)果表明，CsBAFF可能是通過調(diào)節(jié)淋巴細胞增殖來抵抗細菌和病毒感染的重要免疫基因，為魚免疫系統(tǒng)研究提供了新見解。

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