3種防治草莓灰霉病化學殺菌劑的篩選及復配效果研究

劉華琪 文夢夢 吳小新 薛滿滿 張晉睿 許潔 鄭志天

摘要 [目的]明確不同殺菌劑復配對草莓灰霉病的防治效果。[方法]采用菌絲生長速率抑制法測定咯菌腈、氟硅唑、啶酰菌胺3種化學殺菌劑對淮安地區草莓灰霉病菌的室內毒力。[結果]3種藥劑均對草莓灰霉病菌有抑制活性，其中咯菌腈和氟硅唑的抑菌效果最為明顯，所測菌株EC 50的平均值分別為0.018 4和0.264 5 μg/mL。將咯菌腈和氟硅唑按照不同比例進行復配，復配劑對草莓灰霉病菌的抑菌活性均表現出相加作用，配比為2∶1和1∶3時相加作用最明顯。[結論]咯菌腈和氟硅唑按2∶1或1∶3的比例復配能夠延緩抗藥性，同時降低農藥用量，該復配劑有待進一步研究。

關鍵詞 草莓灰霉病菌;咯菌腈;氟硅唑;化學復配

中圖分類號 S 482.2 ?文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）18-0140-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.18.034

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Screening of Three Chemical Fungicides against Strawberry Botrytis cinerea and Study on Synergistic Effect

LIU Hua-qi，WEN Meng-meng，WU Xiao-xin et al （Huaiyin Institute of Technology，Huaian，Jiangsu 223003）

Abstract [Objective]To determine the control effect of three fungicides against strawberry Botrytis cinerea. [Method] The indoor virulence of three chemical fungicides，namely，fludioxonil，fluosilazole and boscalid，to Botrytis cinerea in Huaian Area was determined by mycelium growth rate inhibition method.[Result]All the three agents had inhibitory activity against Botrytis cinerea，among which fludioxonil and fluosilazole had the most obvious inhibitory effect.The average value of EC 50 of the tested strains was 0.018 4 and 0.264 5 μg/mL，respectively.Compounded fludioxonil and fluosilazole in different proportions，and both compounds showed additive effect on bacteriostatic activity of Botrytis cinerea.The additive effect was most obvious when the ratio was 2∶1 and 1∶3.[Conclusion]The combination of fludioxonil and fluosilazole at a ratio of 2∶1 or 1∶3 can delay drug resistance and reduce pesticide dosage.So this compound needs further research and development.

Key words Botrytis cinerea;Fludioxonil;Fluosilazole;Combination of chemical agents

由灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers）引起草莓灰霉病害是草莓生產上的主要病害。近年來，由于淮安地區草莓的廣泛種植，草莓灰霉病的問題日益突出[1-2]。灰霉病主要危害草莓果實，嚴重時危害果柄、花梗等，每年造成10%～30%的經濟損失，嚴重時甚至高達89% [3-4]。生產上對草莓灰霉病的防控方法主要包括農業防治（清除病殘體、調控濕溫度、通風透光）、生物防治（枯草芽孢桿菌防治）、化學防治（利用化學農藥）等，其中化學防治具有見效快、節約成本等優勢，一直是防治草莓灰霉病的主要方法[5-9]。

目前防治草莓灰霉病的化學藥劑主要有腐霉利、異菌脲、嘧霉胺、咯菌腈、啶酰菌胺等，但長期大量使用化學藥劑不僅污染土壤，破壞生態結構，還造成農藥殘留，而且容易使病原菌產生抗藥性[10-11]。研究表明，草莓灰霉病菌對腐霉利、異菌脲、嘧霉胺、咯菌腈等藥劑已經產生抗藥性，因此選擇抑菌效果好，能夠延緩藥劑使用壽命的復配技術對防治草莓灰霉病顯得至關重要[12-15]。該研究選用咯菌腈、氟硅唑、啶酰菌胺3種殺菌劑，進行了室內試驗以及復配作用研究，啶酰菌胺是德國巴斯夫公司開發的琥珀酸脫氫酶抑制劑，其作用機制是與病原菌線粒體呼吸鏈電子傳遞體系中復合體Ⅱ結合，進而阻礙呼吸能量代謝，抑制 ATP 的合成，使菌體死亡。且對主要經濟作物的多種灰霉病、菌核病、白粉病具有良好的保護和治療作用[16-17]?？┚妫╢ludioxonil）是一種新型的非內吸性苯基吡咯類殺菌劑，咯菌腈的抑菌機制是通過抑制與葡萄糖磷?；嘘P的轉移酶，使灰霉病菌孢子萌芽、芽管伸長及菌絲體生長受到抑制[18-19]。氟硅唑是三唑類殺菌劑，主要對子囊菌綱、擔子菌綱和半知菌類真菌有效，目前廣泛用于果樹、蔬菜的黑星病、白粉病、黑斑病、炭疽病、根腐病等[20]，作用原理是破壞和阻止麥角甾醇的生物合成，導致細胞膜不能形成，從而使病菌死亡。目前發現氟硅唑對草莓灰霉病也具有較好的防治效果[21]。

研究表明，啶酰菌胺與腐霉利、咯菌腈、唑胺菌酯以及嘧霉胺與咯菌腈的復配劑對草莓灰霉病的防治均有增效作用[22-25]。筆者將咯菌腈和氟硅唑進行不同比例復配，測定其聯合毒力，為草莓灰霉病防治減藥增效，延緩抗藥性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株。

草莓灰霉病野生菌株（Botrytis cinerea）Bc1和Bc9，由筆者所在課題組從淮安地區各大草莓園發病的草莓病果上分離、純化和培養獲得。

1.1.2 試驗藥劑。

98.51%啶酰菌胺原藥（上海秦巴化工股份有限責任公司）;97.9%咯菌腈原藥（江蘇楊農化工集團有限公司）;97%的氟硅唑（南京農業大學殺菌劑實驗室）。

甲醇，分析純，分別溶解咯菌腈、氟硅唑和啶酰菌胺原藥，均配成濃度為1×104 μg/mL的母液，再用甲醇稀釋成系列質量濃度的藥液供試 （表 1）。

1.2 試驗方法

1.2.1 室內毒力測定。采用菌絲生長速率法測定藥劑對草莓灰霉病菌的抑制作用。首先按照表1制作不同藥劑濃度的PDA平板，同時設無藥平板為對照。用打孔器在預培養4 d的草莓菌Bc1、Bc9菌落邊緣打取菌碟，正面朝下接種到含藥平板上，每個處理重復3次，置于27 ℃培養箱黑暗培養。5 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲抑制率，并采用浙大DPS V9.01數據處理系統進行生物測定分析，求出單劑的毒力回歸方程、抑制中濃度EC 50及相關系數r。試驗進行2次。

抑制率=（對照組菌落直徑-含藥組菌落直徑）/對照組菌落直徑×100%

根據上述試驗結果選出毒力較高的咯菌腈和氟硅唑，按照比例混合法進行復配，然后采用菌絲生長速率法對草莓灰霉病菌繼續進行生物測定。先將咯菌腈和氟硅唑母液按照體積比1∶1、2∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12進行復配，再按照表1制備成含藥平板，以無藥平板為對照，用菌絲生長速率法進行測定。得出各復配組合的EC 50值，并采用Wadley法進行復配增效作用評價[26]。

EC 50（th）=（a+b）/[a/EC （A）50+b/EC （B）50]

SR= EC 50（th）/EC 50（ob）

式中，A、B分別代表2種藥劑，a、b分別代表2種藥劑在混劑中所占比例，ob為實際觀察值，th為理論值。當增效系數SR>1.5時為增效作用，0.5≤SR≤1.5為相加作用，SR<0.5為拮抗作用。

1.2.2 離體草莓葉片試驗。首先在溫室中培養健康的易感灰霉病的“紅顏”草莓，選取健康的大葉片用清水洗凈，分別浸泡在濃度為0.26 μg/mL的不同殺菌劑培養皿中10 min，4組殺菌劑分別為咯菌腈、氟硅唑單劑、2∶1和1∶3的咯菌腈與氟硅唑的復配劑，對照組浸泡在無菌清水中。然后將葉片正面向上置于直徑9 cm鋪有潤濕濾紙的培養皿中，每個培養皿中放一片葉片。然后將預培養4 d的草莓菌Bc1、Bc9菌落邊緣打取菌碟，正面朝下接種到葉片正中央并在葉片中央做傷口處理。每個處理重復5個葉片，用封口膜封培養皿于培養箱中 27 ℃光暗交替（光∶暗=12 h∶12 h）培養。每隔2 d用移液槍加0.26 μg/mL濃度的藥液于濾紙片上保持濾紙濕潤，對照組加無菌水濕潤。7 d后，待清水對照充分發病后調查各處理發病情況。

1.3 數據分析 原始數據經 Excel 軟件進行初步處理，采用DPS V 9.01 軟件的專業統計方法對室內毒力數據進行生物測定分析，獲得藥劑的 EC 50、回歸方程以及相關系數;用Photoshop軟件對發病葉片進行處理。

2 結果與分析

2.1 3種殺菌劑對草莓灰霉病的毒力測定

由表2可知，咯菌腈對草莓灰霉菌菌絲生長抑制最強，其EC 50的平均值為0.018 4 μg/mL;其次為氟硅唑，其EC 50的平均值為0.264 5 μg/mL;啶酰菌胺略低于氟硅唑，其EC 50的平均值為0.514 7 μg/mL。因此，選用咯菌腈和氟硅唑進行下一步復配研究。

2.2 咯菌腈、氟硅唑對草莓灰霉病菌的復配比例篩選

咯菌腈是防治草莓灰霉病的特效藥劑，近年來，隨著咯菌腈的大量使用，田間已經出現對咯菌腈有抗性的草莓灰霉病菌株[27]。而氟硅唑通常認為防治子囊菌效果較好，Wang等[21]發現，氟硅唑對草莓灰霉病也具有良好的防治效果，且田間沒有抗藥性菌株出現。因此，該研究對咯菌腈和氟硅唑進行復配，以期達到延緩咯菌腈抗藥性的發生。由表3可知，不同配比的咯菌腈和氟硅唑復配劑均對草莓灰霉菌有抑制效果，EC 50在0.033～0.210。由于咯菌腈的毒力高于氟硅唑，其抑制中濃度遠低于氟硅唑。為了減少咯菌腈的使用量達到延緩抗藥性的目的，在復配物中提高氟硅唑所占的比例，幾乎所用的復配劑均表現為相加作用。尤其當咯菌腈與氟硅唑以2∶1和1∶3復配時，增效系數最高，相加作用最明顯。

2.3 草莓離體葉片防效

對篩選出來的藥劑和復配比例進行了草莓離體葉片試驗，用草莓灰霉病菌Bc1和Bc9對氟硅唑的平均EC 50 值0.26 μg/mL 處理草莓葉片，觀察不同藥劑與不同復配比例對草莓灰霉病菌的防治效果。從圖1可以看出，接種草莓葉片7 d后，未用藥劑處理的葉片變黑，表面凹陷腐爛，產生白色菌絲，病斑占整個葉片3/4以上。而用0.26 μg/mL咯菌腈處理的葉片，僅在接種傷口部位有輕微的褐色病斑，說明咯菌腈對草莓灰霉病的防效最好。用0.26? μg/mL氟硅唑處理的葉片，病斑大小接近葉片的1/2，符合中濃度抑制效果?？┚媾c氟硅唑按2∶1和1∶3復配劑處理結果表明，病斑大小占整個草莓葉片的1/4～1/3，也具有相當好的防治效果，且該復配劑對延緩草莓灰霉病對咯菌腈的抗藥性、減少草莓生產上對咯菌腈的依賴具有重要意義。

3 結論與討論

草莓灰霉病菌繁殖速度快，寄主范圍廣，對環境適應性強，是高抗風險的病原物，已對多種農藥產生抗藥性[28]。而將殺菌劑進行混配可明顯降低草莓灰霉病抗藥性群體的形成，同時還具有擴大殺菌譜、增強藥效、減少農藥用量、降低成本等優點。單一使用咯菌腈對草莓灰霉病具有極好的防治效果，其EC 50為0.018 4 μg/mL左右，但田間已經出現抗藥性菌株，使得該藥劑的持續施用具有較大風險。而氟硅唑是三唑類殺菌劑，主要對子囊菌綱、擔子菌綱和半知菌類真菌有效，目前廣泛用于果樹、蔬菜的黑星病、白粉病、黑斑病、炭疽病、根腐病等方面。該研究表明，氟硅唑對草莓灰霉病也具有良好的防治效果，其EC 50在0.264 5 μg/mL左右。

該試驗首次將作用機理不同的咯菌腈和氟硅唑藥劑進行復配，結果表明不同復配比例的咯菌腈和氟硅唑對草莓灰霉病均具有良好的抑制效果，增效作用均為相加作用，尤其以質量比2∶1和1∶3的復配對草莓灰霉病的相加作用最明顯，離體草莓葉片試驗也證明該復配比例的有效性。該結果不僅有助于延長2種藥劑的使用壽命，而且增加了防治草莓灰霉病的新藥劑，建議生產上推廣應用。

該試驗僅研究了咯菌腈和氟硅唑復配物對草莓灰霉病的防治效果，而這2種藥劑對其他病原菌，如油菜菌核病菌、草莓白粉病、草莓炭疽病是否也具有良好的防治作用，值得進一步研究。因為氟硅唑成分對子囊菌綱具有抑制作用，推測其對草莓白粉病及草莓炭疽病也具有防治效果。則該復配劑將一次性解決草莓生產上的三大病害，即草莓灰霉病、草莓白粉病及草莓炭疽病，使得該混劑既解決草莓生產上抗藥性難題，也解決了草莓病害難以防治、草莓生產用藥量大等問題，對草莓生產減藥增效、保護環境具有重大意義。

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