ERRα通過調控肌鈣蛋白I表達促進心肌細胞成熟的機制*

陳聰 楊月星 黃安芳 付虎

(1.成都市第一人民醫院,四川 成都 610016;2.西南醫科大學附屬第一醫院,四川 瀘州 646000)

心臟是有脊椎動物最早發育的器官[1]，過去學者多關注心臟在胚胎發育期間諸多基因在時間、空間上的有序表達[2]，然而近些年研究提示，在出生后，心臟將經歷最后的成熟階段，這個階段對于最終完美心臟功能的實現至關重要[3]。心肌細胞成熟(cardiomyocytes maturation)主要包括心肌細胞能量代謝方式的轉換，即糖酵解為主要供能方式轉換成脂肪酸氧化(FAO)；心肌細胞肌絲蛋白亞型轉換，如由胚胎型肌鈣蛋白I(ssTnI)逐漸向心肌肌鈣蛋白(cTnI)轉換，胚胎型肌球蛋白重鏈(βMHC)向成熟型肌球蛋白(αMHC)轉換以及離子通道相關基因表達水平的變更[3-4]。近幾年有研究提示雌激素受體α(ERRα)在心肌細胞成熟過程中對能量代謝相關基因具有直接調控作用[5-6]。如文獻提示ERRα可作為轉錄因子直接調控脂肪酸氧化代謝相關基因Acsl1表達升高，而下調調控糖酵解通路的Acsl3基因表達[5]。同時期對心肌細胞離子通道相關基因表達亦具有重要調控作用[5]。因此推測其可能在肌絲蛋白亞型轉換中也發揮關鍵作用,本文探討雌激素受體α(ERRα)在心肌細胞成熟過程中調控機制，現將結果報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 選取三級無特殊病原體動物(SPF級)c57小鼠(購于四川大學華西基礎醫學院動物中心)，按雄雌1:2比例合籠，次日觀察陰栓，觀察到陰栓最早之日計為孕期E0.5。取E14.5、E17.5、新生小鼠、生后2周及生后4周小鼠為研究對象，設為E14.5組(胎齡14.5天)、E17.5組(胎齡17.5天)、NB組(新生小鼠)、P2W組(生后2周)、P4W組(生后4W)，每組各4只。采用二氧化碳窒息處死小鼠，隨即取出心臟組織備用。本實驗對動物處理符合動物倫理要求，并經成都市第一人民醫院倫理委員會審核同意。

1.2 主要試劑和儀器 抗組蛋白H3乙酰化抗體(ab1791)；工作濃度1∶1000；抗ERRα抗體(1ERR87)抗ssTnI抗體(ab203515)、抗cTnI抗體(ab209809)，工作濃度1∶2000；抗β-actin鼠單克隆抗體(ab8227)，工作濃度1∶1000；ChIP試劑盒(ab500)(Abcam 英國)；山羊抗兔及山羊抗小鼠帶HRP標記的IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司)；凱基全蛋白提取試劑盒(凱基生物，中國，KGP 2100)；總RNA提取試劑盒(凱基生物，中國，KGA 1203)；逆轉錄試劑盒(TaKaRa公司，日本)；實時定量PCR試劑盒(天根生化技術有限公司)。凝膠圖像分析儀(Gene公司，美國)；熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司，美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 Western blot實驗 小鼠心臟組織獲取后根據全蛋白提取試劑盒操作提取蛋白組織；上樣量為30 μg, 點樣在10%的SDS-聚丙酰胺凝膠上進行電泳后電轉至0.22 μm的PVDF膜上，用封閉液稀釋Ⅰ抗后4 ℃10小時，洗膜后再孵育Ⅱ抗(1∶3000稀釋)，室溫下孵育2 h后再洗膜后用化學發光成像，將條帶輸入Quantity one軟件獲得其灰度值，以目的蛋白/β-actin(灰度值)來反映蛋白的相對表達量。

1.3.2 實時定量PCR實驗 收集心臟組織標本后進行相應目標基因mRNA檢測。ERRα上游引物序列5′-CACAAGAGCTTGAGCGATT-3′ 下游引物序列為5′- CAGGCTGGAC TTCTACGAT-3′，產物長度為127 bp；ssTnI的上游引物序列為5′-AAGACGTAGCCTACTGCTG-3′，下游引物序列為5′-ATGCCGCTATGTGA GTAGC-3′，產物長度為142 bp；cTnI的上游引物序列為5′-CCTGCACCGATACCGATT-3′，下游引物序列為5′-CCGTCGAATGCTC GCACTG-3′，產物長度為135 bp；αMHC的上游引物序列為5′-GCCTGGAATAATACCCGAG-3′, 下游引物序列為5′-ATCCGCTGCATTCCTAATCT-3′，產物長度114 bp；βMHC上游引物序列為5′-AGC GTTGATTCATCGAT-3′，下游引物序列為5′-ATC GATGAATCAACGCT-3′。選取β-actin作為內參基因。所得數據用Bio-RadCFX96 熒光定量PCR 儀自帶基于Pfaffl 原理的相對定量數據分析軟件分析。

1.3.3 染色質免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP)實驗 按照ChIP試劑盒進行操作，心臟70 mg，勻漿，預冷PBS 清洗后加入1%的甲醛交聯15 min。超聲破碎儀將DNA 切割至200～1 000 bp之間。加入ChIP 級抗ERRα抗體及乙酰化組蛋白H3抗體4 ℃沉淀DNA，65 ℃逆轉交聯，純化并回收DNA。于-20 ℃保存。

1.3.4 ChIP-qPCR實驗 選取cTnI、ssTnI、αMHC及βMHC基因外顯子5′端前1000 bp 序列，針對該序列設計特異性引物。引物用Primer Premier 5.0 軟件設計，由寶生物公司合成。cTnI的上游引物序列為5′-ATCGGATTCAGGTACCG-3′，下游引物序列為5′-CGGTACCTGAATCCGAT-3′，產物大小為133 bp;ssTnI上游引物序列為5′-AACTGCCGATTCAGTTATC-3′，下游引物序列為5′-GATAACTGAATCGGCAGTT-3′，產物大小為128 bp;αMHC的上游引物序列為5′-TCACTCTTCTCGTACCCACACAA-3′，下游引物序列為5′-CGGGAGAAGTGATGGGGTAACG-3′，產物大小為118 bp; βMHC上游引物序列為5′-TAACGATTCGTAATTCGG-3′，下游引物序列為5′-CCGAATTACGAATCGTTA-3′，產物大小為117 bp。所得數據用Bio-RadCFX96 熒光定量PCR 儀自帶基于Pfaffl 原理的相對定量數據分析軟件分析。

2 結果

2.1 心臟發育及成熟過程中ERRα及肌絲蛋白各亞型mRNA表達時序 運用qPCR方法檢測小鼠心臟中ssTnI、cTnI、αMHC、βMHC及ERRα的mRNA表達水平，結果發現從胚胎E14.5天開始，ERR表達水逐漸升高，至生后2周表達達峰值，后維持在此水平，P2W組與E14.5組、E17.5組、NB組比較差異均有統計學意義(均P<0.05)，較P4w組比較差異無統計學意義(P>0.05)(見圖1A)。與ERRα表示時序性相似，cTnI轉錄水平從E14.5時期逐漸升高，至出生后2周表達達高峰，維持在此水平，P2W組較E14.5組、E17.5組、NB組比較差異有統計學意義(均P<0.05)，較P4W組比較差異無統計學意義(P>0.05)(見圖1B)。αMHC從E14.5天表達水平亦逐漸升高，但其在出生后四周，即小鼠心臟發育完全成熟期表達達峰值，P4W組較E14.5組、E17.5組、NB組及P2W組比較差異有統計學意義(均P<0.05)(見圖1C)。ssTnI及βMHC mRNA表達水平則在心臟發育過程中逐漸下降，E14.5組較NB組、P2W組及P4W組比價差異有統計學意義(均P<0.05),與E17.5組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1D、圖1E。

圖1 心臟發育及成熟階段各基因mRNA相對表達(n=4)

2.2 心臟發育及成熟過程中ERRα及肌絲蛋白各亞型蛋白表達時序 運用western blot方法檢測小鼠心臟中ssTnI、cTnI及ERRα的蛋白表達水平。小鼠心臟發育及成熟過程中ERRα、cTnI、ssTnI蛋白表達水平與mRNA表達水平相同，見圖2。

2.3 肌絲蛋白各亞型啟動子組蛋白乙酰化水平 組蛋白乙酰化動態調控基因轉錄，ChIP結合Q-PCR方法進一步檢測ssTnI、cTnI、αMHC及βMHC啟動子區域組蛋白乙酰化水平。cTnI啟動子組蛋白乙酰化水平在生后2周達峰值，P2W組與E14.5組、E17.5組及NB組相比，差異均有統計學意義(P<0.05)，與P4W組比較差異無統計學意義(P>0.05)。ssTnI、αMHC及βMHC啟動子區域組蛋白乙酰化水平在各組間差異無統計學意義(P>0.05),見圖3。

圖3 心臟發育及成熟階段各基因啟動子組蛋H3乙酰化水平(n=4)

2.4 ERRα與肌絲蛋白基因亞型啟動子結合水平 利用ChIP-Q-PCR方法檢測轉錄因子ERRα與ssTnI、cTnI、αMHC及βMHC啟動子區域結合水平。發現ERRα與cTnI啟動子結合水平在出生后2周達峰值，P2W組與E14.5組、E17.5組及NB組相比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)，與P4W組比較差異無統計學意義(P>0.05)。ERRα與ssTnI啟動子結合水平在E14.5組心臟組織中最高，與NB組、P2W組及P4W組比較，差異有統計學意義(均P<0.05)，與E17.5組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。ERRα與αMHC及βMHC啟動子區域結合水平在各組間差異無統計學意義(均P>0.05)。

圖4 心臟發育及成熟階段ERRα與各基因啟動子結合水平

3 討論

心臟成熟涉及能量代謝方式的轉換，肌絲蛋白亞型轉換及適應出生后心肌細胞微環境及收縮/舒張力的改變，以及離子通道基因亞型的轉換等[7]。肌絲蛋白亞型轉換這一現象已為人所熟知，但其內在機理目前仍不明確。心肌細胞能量代謝是肌絲蛋白收縮、舒張的核心環節[8-10]，因此近些年有學者認為，能量代謝是心肌細胞走向成熟的始動因素[5]。而ERR作為轉錄因子與心肌細胞能量代謝密切相關，其可直接調控PGC1-α而影響心肌細胞能量代謝通路[11-12]。因此，我們對ERRα在心臟成熟過程中的可能作用進行了初步研究。

肌絲蛋白亞型轉換涉及眾多基因調控，其中肌鈣蛋白I及肌球蛋白重鏈在心臟成熟過程中變化最為人所熟知[13-14]。本研究的數據與以往研究相符合，即心臟發育及成熟過程中胚胎型肌鈣蛋白及肌球蛋白重鏈逐漸向成熟亞型轉換。同時我們還發現ERRα表達時序性與成熟型肌絲蛋白，如cTnI及αMHC相同。而與胚胎型ssTnI及βMHC趨勢相反。提示我們其可能參與這些下游肌絲蛋白亞型轉換。

為了進一步探討肌絲蛋白亞型轉換的可能機理，檢測了各個基因啟動子區域組蛋白H3乙酰化水平。組蛋白乙酰化作為重要的轉錄調控因素[15-17]，其動態調控染色質結構，進而影響基因轉錄活性[18-21]。我們發現，cTnI啟動子乙酰化水平與之表達水平正相關，提示組蛋白乙酰化可能在其表達中具有重要作用。然而其在ssTnI、αMHC及βMHC啟動子區域則則各個發育時間點間無明顯統計學差異。提示可能有其他機制參與這些基因動態表達。

ERRα是ERR重要亞型之一[22-23]，有研究顯示其心臟特異性敲除可導致胚胎心臟發育異常，線粒體功能及結構紊亂[5,24-25]。我們對其是否能夠直接調控肌絲蛋白亞型轉換進行了初步驗證。我們數據提示，ERRα可直接結合與ssTnI及cTnI啟動子區域，同時期結合水平與二者表達時序性一致，提示在肌鈣蛋白I亞型轉換中，ERRα可能扮演重要角色。鑒于cTnI啟動子組蛋白乙酰化水平的時序規律，我們推測組蛋白乙酰化可能介導了ERRα動態調控cTnI在心臟發育及成熟過程中的時許表達。

4 結論

本研究結果提示，在心肌細胞發育及成熟過程中，ERRα可能直接參與調控肌鈣蛋白Ⅰ亞型轉換，而組蛋白乙酰化可能介導了ERRα與cTnI啟動子的結合，并參與其調控，盡管ERRα亦直接調控ssTnI，但組蛋白乙酰化并不是其中間關鍵環節。同時ERRα與肌球蛋白重鏈亞型轉換存在相關性，但其并不直接參與其轉錄表達，故還需要更多研究進一步明確其潛在機制。