SCNN1B在非小細胞肺癌組織中的表達及其調節肺癌對順鉑的敏感性*

丁家寶 高鯤 張倩 梁華剛 劉赫 李建

(秦皇島市第一醫院1.胸外科；2.風濕免疫科，河北 秦皇島 066000)

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是肺癌的主要病型，約占所有肺癌的80%左右，數據報道65%～70%的NSCLC患者在確診時已處于中晚期，失去手術機會，以化療為主的綜合治療是患者取得生存獲益的關鍵醫療措施[1-2]。順鉑聯合吉西他濱(Cisplatin Combined With Gemcitabine,GP)是當前臨床治療晚期NSCLC的一線化療方案，臨床應用廣泛，雖能獲得良好的療效，但有效率僅為20%～40%[3]。多數研究認為腫瘤耐藥是影響化療有效率的重要影響因素之一，也是患者預后不良的獨立危險因素[4-5]。探尋與NSCLC臨床特征、化療耐藥相關的生物新標志物，于NSCLC早期診療工作、預后評估、開發新的治療靶點及改善遠期生存上均有積極意義。SCNN1B是新抑癌基因，往期研究已證實其在胃癌等惡性腫瘤疾病中存在異常低表達現象[6]。但少見SCNN1B表達與NSCLC患者化療藥物敏感性的研究。故本研究采集資料，分析SCNN1B在NSCLC中的表達，并進一步探討其調節肺癌對順鉑敏感性的價值，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年12月～2019年12月在本院診治為NSCLC患者的病理標本130例。其中男102例、女28例；年齡44～79歲，平均(60.18±8.42)歲；88例吸煙；中高分化88例，低分化62例；鱗癌68例，腺癌62例；國際肺癌研究學會(IASLC)NSCLC TNM分期Ⅲ期94例、Ⅳ期36例。A549細胞株、順鉑耐藥株A549/DDP細胞株購自北京北納創聯生物科技有限公司。納入標準：①年齡>18周歲。②晚期NSCLC。③病理組織標本采集前未接受過癌癥相關放化療治療。排除標準：①臨床資料缺失。②病理標本采集前接受過NSCLC相關治療。

1.2 試劑與儀器 單克隆抗體(美國cell signaling Technology公司)；順鉑DDP(上海Selleck公司)；HRP標記的抗鼠或抗兔二抗(武漢Proteintech公司)；CCK8及Annexin-V/PI凋亡試劑盒(杭州聯科生物技術有限公司)；引物、siRNA-SCNN1B、siRNA陰性對照(上海吉瑪制藥技術有限公司)；Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司)；HiScript II One Step RT-PCR Kit (Dye Plus)試劑盒(Vazyme Biotech Co.,Ltd)；cDNA逆轉錄試劑盒(上海普洛麥格生物產品有限公司)；LightCycler 96實時熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司)；引物序列合成(上海Invitrogen公司)。

1.3 方法

1.3.1 NSCLC組織SCNN1B表達 取NSCLC患者病理標本，含液氮的研缽中充分研磨，Trizol試劑盒說明書提取組織總RNA并檢測RNA濃度；參照cDNA逆轉錄試劑盒合成cDNA，應用LightCycler 96實時熒光定量PCR儀檢測組織中SCNN1BmRNA表達；PCR反應體系：Real Master 23 μL，上下游引物各0.4 μL，探針0.7 μL、Taq酶0.5μL，模板5 μL；總反映體系30 μL；反應條件：94℃10 s變性，60℃30 s退火和延伸，循環數60個；以為β-action為內參，2-△△Ct法計算SCNN1BmRNA相對表達量。

1.3.2 SCNN1B調節肺癌對順鉑敏感性檢測 ①SCNN1B轉染：A549、順鉑耐藥株A549/DDP細胞株常規應用RPMI-1640培養基培養，取對數生長期細胞，按3×104～4×104個/mL密度接種至96孔板；設A549細胞組、A549/DDP細胞組、siRNA-SCNN1B組、siRNA-NC組，每組設6個復孔；其中siRNA-SCNN1B組、siRNA-NC組待細胞生長至60%匯合時加入SCNN1B過表達質粒及空載質粒(陰性對照)，參照Lipofectamine 2000試劑盒說明書轉染siRNA-SCNN1B(5′-GGATCGGGAAAGTAAAGAAATT-3′)、siRNA-NC(5′-UUCUCCGAACGUGUGACGU TT-3′)，構建穩定過表達siRNA基因的A549/DDP(siRNA-SCNN1B)細胞、siRNA-NC細胞；參照Trizol試劑盒說明書提取各組細胞RNA并檢測RNA濃度，逆轉錄呈cDNA后參照RT-PCR試劑盒說明書檢測SCNN1BmRNA表達(F：5′-GCCTTCTCTGCTATGTCTGAA-3′；R：5′-CTGATGAACACACACCAACTT-3′)；擴增條件：95℃5 min、95℃10 s、60℃30 s，40個循環；95℃15 s、60℃60 s、95℃15 s終止反應；以β-actin(F：5′-CCACTGGCATCGTGATGGACTCC-3′；R：5′-GCCGTGGTGGTGAAGCTGTAGC-3′)為內參，計算SCNN1BmRNA相對表達量，驗證SCNN1B轉染效果。②細胞藥物敏感性檢測：取A549細胞組、A549/DDP細胞組、siRNA-SCNN1B組、siRNA-NC組細胞，按3×105個/mL密度接種至96孔板，每組設6個平行孔，按濃度梯度(1、2、4、16、32、64、128、256 μg/mL)加入順鉑，培養72 h后使用Vi-cell細胞活力分析儀測定細胞活力，計算半數抑制濃度(IC50)。③細胞凋亡及細胞周期檢測：取A549細胞組、A549/DDP細胞組、siRNA-SCNN1B組、siRNA-NC組細胞，按3×105個/mL密度接種至96孔板，每組設6個平行孔，按濃度梯度(5、10 μmol/mL)加入順鉑，培養24 h后收集細胞，不經EDTA胰酶消化離心處理，預冷的PBS液沖洗2次，每管用500 μL標記緩沖液重懸，避光，先加入5 μL Annexin V-FITC，上機前15 min加入5 μL PI進行流式細胞檢測，分析細胞凋亡率及細胞周期。④耐藥相關蛋白表達：采用Western blot法檢測Bcl-2、生存素(Survivin)、周期蛋白D1(CyclinD1)、表皮生長因子受體(EGFR)、多藥耐藥相關蛋白-1(MRP1)、肺耐藥相關蛋白(LRP)表達；取A549細胞組、A549/DDP細胞組、siRNA-SCNN1B組、siRNA-NC組細胞，按3×105個/mL密度接種至96孔板，24 h后收集細胞裂解液提取蛋白，BCA法測定細胞裂解物中蛋白含量，取等量蛋白質，以10% SDS-PAGE法分離并轉移至PVDF膜一抗孵育4℃過夜、洗去一抗，HRP連接的二抗在37℃條件下孵育2 h，洗滌，ECL顯色、曝光分析結果，以β-action為內參。

1.3 統計學分析 采用SPSS 22.0版進行統計學分析，計數資料采用率(%)描述，組間比較采用2檢驗；計量資料以均數±標準差表示，單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P<0.05為差異統計學意義。

2 結果

2.1 SCNN1B在非小細胞肺癌組織中的表達 130例NSCLC患者SCNN1BmRNA表達量為0.48(0.12，1.19)；以0.48為中位數，低表達(≤0.48)96例，高表達(>0.48)34例；低分化患者中SCNN1BmRNA低表達率明顯高于中高分化患者，TNM分期Ⅳ期患者中SCNN1BmRNA低表達率明顯高于Ⅲ期(P<0.05)，見表1。

表1 SCNN1B在非小細胞肺癌組織中的表達[n(×10-2)]

2.2 SCNN1B調控NSCLC對順鉑的敏感性

2.2.1 SCNN1B表達量 A549細胞組、A549/DDP細胞組、siRNA-SCNN1B組、siRNA-NC組SCNN1BmRNA水平分別為(1.22±0.21)、(0.72±0.10)、(0.97±0.12)、(0.70±0.09)，差異均有統計學意義(F=18.765，均P<0.05)；其中A549/DDP細胞組SCNN1BmRNA水平顯著低于A549細胞組(t=6.508，P<0.05),與A549/DDP細胞組比較，siRNA-SCNN1B組SCNN1BmRNA水平明顯上升(t=3.379，P<0.05)。

2.2.2 細胞活力檢測 與siRNA-NC組細胞比較，順鉑作用24 h后，siRNA-SCNN1B組對順鉑的敏感性明顯增加，siRNA-SCNN1B組對順鉑的半數抑制濃度為(22.17±1.35)μmol/L，明顯低于siRNA-NC組的(48.58±3.14)μmol/L，逆轉系數下降(221.69±26.27)%，差異有統計學意義(t=18.927，P<0.05)。

2.2.3 細胞凋亡、細胞周期檢測 與A549細胞組比較，A549/DDP細胞組細胞凋亡率明顯下降(t=24.476，P<0.05)，siRNA-SCNN1B組細胞凋亡率則較A549/DDP細胞組明顯上升(t=16.579，P<0.05)；在細胞周期上，與A549細胞組比較，A549/DDP細胞組細胞周期G0/G1期比例明顯上升(t=9.439，P<0.05))，siRNA-SCNN1B組的細胞周期G0/G1期比例則較A549/DDP細胞組明顯下降(t=5.595，P<0.05))。見表2。

表2 細胞凋亡、細胞周期檢測

2.2.4 Bcl-2、生存素、細胞周期蛋白D1表達 與A549細胞組比較，A549/DDP細胞組Bcl-2、生存素、Cyclin D1水平明顯上升(t=12.359、38.140、27.923，均P<0.05)；siRNA-SCNN1B組Bcl-2、生存素、Cyclin D1水平則較A549/DDP細胞組明顯下降(t=3.237、2.674、3.943，均P<0.05)。見表3。

表3 Bcl-2、生存素、Cyclin D1表達

2.2.5 相關多藥耐藥蛋白表達 與A549細胞組比較，A549/DDP細胞組EGFR、MPR1、LRP水平明顯上升(t=7.467、9.859、10.844，均P<0.05)；siRNA-SCNN1B組EGFR、MPR1、LRP水平則較A549/DDP細胞組明顯下降(t=3.992、6.062、5.434，均P<0.05)。見表4。

表4 相關多藥耐藥蛋白表達

3 討論

肺癌是我國城市人口惡性腫瘤死因首位，NSCLC占肺癌的80%，其中75%的患者在確診時病情已為中晚期，是影響國人生命健康的重要疾病之一[7]。探究肺癌的發病機制、耐藥機制分子標記物，為肺癌診治通過思路及理論依據于緩解我國甚至全球癌癥負擔有益。SCNN1B基因位于染色體16p12.2-p12.1，當前關于SCNN1B的研究多集中在原發性高血壓、醛固酮增多癥上[8-10]。但有研究通過甲基化芯片掃描證實在人類胃癌中，SCNN1B基因啟動子CpG區域呈高甲基化表達，并在細胞試驗中證實人類胃癌細胞株中SCNN1B沉默表達，認為與SCNN1B基因啟動子CpG區域甲基化有關，作為新抑癌基因，SCNN1B或可作為抑癌基因參與胃癌發生發展[11]。但SCNN1B與惡性腫瘤疾病的關系仍需大量循證醫學證據佐證。本研究結果與雷銳等[12]的研究結論相似，均提示SCNN1BmRNA與NSCLC患者組織分化程度、臨床分期具密切關聯。雷銳等通過基因探針富集分析(GSEA)證實SCNN1B可通過與細胞周期、DNA修復、錯配修復等一系列信號通路發揮抑癌基因作用，且SCNN1B高表達的NSCLC患者具更長的總生存期及無復發生存期[HR(95%CI)：0.62(0.46～0.85)、0.44(0.26～0.95)]。

化療治療是挽救中晚期肺癌患者主要手段。順鉑是肺癌的基礎治療性藥物，可與腫瘤細胞的DNA形成順鉑加合物來激發腫瘤細胞循環停止、凋亡過程，但易產生腫瘤耐藥[13-14]。因此本研究開展細胞試驗明確SCNN1B對順鉑敏感性的影響。研究顯示，A549/DDP細胞組SCNN1BmRNA水平顯著低于A549細胞組；與A549/DDP細胞組比較，siRNA-SCNN1B組SCNN1BmRNA水平明顯上升；與siRNA-NC組比較，順鉑作用24h后，siRNA-SCNN1B組細胞對順鉑的敏感性明顯增加，siRNA-SCNN1B組對順鉑的半數抑制濃度明顯低于siRNA-NC組。同時本研究還顯示與A549細胞組比較，A549/DDP細胞組細胞凋亡率明顯下降，siRNA-SCNN1B組細胞凋亡率則較A549/DDP細胞組明顯上升；在細胞周期上，與A549細胞組比較，A549/DDP細胞組細胞周期G0/G1期比例明顯上升，siRNA-SCNN1B組細胞周期G0/G1期比例則較A549/DDP細胞組明顯下降。由此可見，與A549細胞比較，在順鉑耐藥的A549細胞株中SCNN1B明顯低表達，靶向上調SCNN1B后半數抑制濃度上調，細胞凋亡率上升，細胞周期G0/G1期比例下降；提示SCNN1B與肺癌對順鉑的敏感性有密切關聯。

為進一步探究其耐藥機制，本研究分析了SCNN1B對Bcl-2、生存素、Cyclin D1的影響。Bcl-2是反映細胞凋亡的重要蛋白，其可抑制腫瘤細胞凋亡，且其高表達與腫瘤耐藥存在密切關聯[15-16]。生存素是凋亡抑制蛋白家族成員，具典型的腫瘤特異性，在抑制腫瘤細胞凋亡、促進腫瘤細胞增殖及血管新生上扮演重要角色[17-18]。而Cyclin D1則屬細胞周期基因，可通過調控細胞周期G1期參與腫瘤細胞的惡性增殖，在多種腫瘤疾病中均呈異常高表達現象，且其水平與腫瘤惡性程度、惡化程度、預后顯著相關[19-20]。而本研究顯示與A549細胞比較，原發A549/DDP細胞中Bcl-2、生存素、Cyclin D1水平明顯上升，SCNN1B轉染A549/DDP細胞的Bcl-2、生存素、Cyclin D1水平則較原發A549/DDP細胞明顯下降。提示靶向上調SCNN1B可促進肺癌順鉑耐藥細胞凋亡。Qian等[21]也報道，SCNN1B可降解GRP78抑制胃癌生長及轉移，這與本研究結論相似。EGFR、MPR1、LRP均是耐藥相關蛋白[23-25]，本研究顯示，靶向上調SCNN1B可抑制EGFR、MPR1、LRP等耐藥相關蛋白表達，從而改善甚至逆轉肺癌順鉑耐藥。

4 結論

NSCLC患者SCNN1B與肺癌組織分化程度、腫瘤分期存在密切關聯，肺癌耐藥細胞存在Bcl-2、生存素、Cyclin D1、EGFR、MPR1、LRP等凋亡相關蛋白及耐藥蛋白表達異常，靶向上調SCNN1B可抑制上述凋亡相關蛋白及耐藥蛋白表達，促進細胞凋亡并阻滯細胞周期。