達卡巴嗪長循環脂質體的制備及體內抗腫瘤效應*

王麗 朱九群 龍超 何林 董文娟

(1.南充市中心醫院藥學部·個體化藥物治療重點實驗室，四川 南充 637000； 2.四川省人民醫院藥學部，四川 成都 610072；3.電子科技大學醫學院，四川 成都610072)

惡性黑色素瘤是黑色素細胞惡變而來的腫瘤，惡性程度高。黑色素瘤發現越早，治愈可能性越大，預后越好。90%～95%早期惡性黑色素瘤可以經外科手術治愈，中、晚期手術治療效果較差，一般建議以內科治療為主的全身系統治療[1]。

美國FDA 1975年將達卡巴嗪(dacarbazine,DTIC)批準用于惡黑的化療[2-6]。長期以來是黑色素瘤化療的“金標準”，但DTIC在臨床使用中存在穩定性差，患者順應性低，不良反應嚴重，對腦轉移無效等缺陷[9-10]。

脂質體(liposome,LP)目前已成為一種有效的藥物遞送系統。相比普通劑型，脂質體能改善藥物的藥代動力學和藥效學并降低藥物的毒副作用[11-13]。但普通脂質體易被血管和肝脾吞噬細胞迅速吞噬，用聚乙二醇對脂質體進行表面修飾可屏蔽機體網狀內皮系統對脂質體的識別，延遲肝脾清除，使藥物體內循環時間延長，被稱為隱形脂質體(Stealth liposome,SL)，又稱為長循環脂質體(long circulating liposome,LCL)[14-18]，還可通過EPR效應自發往腫瘤中聚集，發揮靶向作用[19-20]。本文擬制備PEG修飾的DTIC長循環脂質體(PEG-DTIC-LP)，對其體內的抗腫瘤效應進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 一般材料 N-1200A旋蒸儀購自東京理化器械株式會社；JY92-IIDN超聲波細胞破碎機購自寧波新芝生物科技公司；Universal 320R離心機購自德國Hettich公司； Malvern Zetasizer Nano ZS90納米激光粒度儀購自英國Malvern公司；透射電鏡購自美國FEI公司；DTIC購自蘇州立新制藥有限公司；大豆卵磷脂、膽固醇、硫酸銨購自成都科龍化工試劑廠；DSPE-PEG2000購自上海RVT醫藥科技公司；B16-F10細胞購自ATCC細胞庫。健康SPF級C57BL/6小鼠，六周齡，體重18～22g，雌雄各半，由四川省人民醫院實驗動物中心提供，實驗動物許可證號SYXK(川)2013-110。本試驗動物的處理符合動物倫理要求，并經南充市中心醫院倫理委員會審核同意。

1.2 方法

1.2.1 PEG-DTIC-LP的制備及性質表征 采用硫酸銨梯度法制備PEG-DTIC-LP[21]。按70∶5∶25摩爾比稱取大豆卵磷脂、DSPE-PEG2000、膽固醇裝入圓底燒瓶，用適量三氯甲烷充分溶解，于旋蒸儀上旋蒸去掉有機溶劑后在瓶底形成無色透明薄膜，加入0.3 mol/L硫酸銨溶液適量，繼續旋蒸形成乳白色混懸液，用超聲波細胞破碎機超聲5 min即制得空白脂質體。將空白脂質體裝于透析袋中，用5% GS溶液透析8 h，每小時換一次透析液。透析完成后將處方量DTIC加入空白脂質體，40 ℃孵育20 min，即得1mg/mL的PEG-DTIC-LP混懸液。

1.2.1.1 包封率和載藥量 將PEG-DTIC-LP置于超濾離心管中離心可得游離DTIC溶液，采用紫外分光光度法測定DTIC濃度，按公式1和公式2計算包封率和載藥量。

(公式1)

(公式2)

1.2.1.2 外觀和形態 肉眼觀察PEG-DTIC-LP混懸液的質地、顏色；采用負染法處理樣品，用透射電鏡觀察其微觀形態。

1.2.1.3 粒徑分布和Zeta電位 采用Malvern Zetasizer Nano ZS90粒度儀測定PEG-DTIC-LP的粒徑、分布及Zeta電位。

1.2.1.4 穩定性考察 將新制備的PEG-DTIC-LP混懸液放置于4℃冰箱冷藏，觀察其外觀變化并逐周測定包封率，考察其載藥穩定性。

1.2.1.5 體外釋藥性 取1 mL PEG-DTIC-LP混懸液于MW3500透析袋中，放置于50 mL 10mmol/L的 PBS 6.5和PBS 7.4透析液中，設置37℃恒溫搖床100 r/min持續振搖。分別于時間點1、2、4、8、12、24小時吸取透析液500 μL測定DTIC濃度，每次取液后需補充500 μL對應空白透析液。最后一個時間點取完后將透析袋中的PEG-DTIC-LP混懸液倒入釋放介質中，并加入10%Triton X-100溶液50 μL，吸取該混合溶液500 μL測定DTIC濃度。DTIC濃度的測定采用紫外-可見分光光度法，按公式3計算藥物累積釋放率，繪制體外累積釋藥曲線圖[22-23]。

(公式3)

1.2.2 PEG-DTIC-LP體內抗腫瘤效應研究 將對數生長期B16-F10細胞用無菌生理鹽水配制成2×106個/ mL的細胞懸液，于C57BL/6小鼠背部皮下注射0.2 mL B16-F10細胞懸液，精心飼養小鼠10天，篩選腫瘤生長良好的小鼠作為荷黑色素瘤小鼠模型。選出24只腫瘤大小及體重相近(23±2.5g)的荷瘤小鼠，分為生理鹽水組、空白脂質體組、DTIC溶液組、PEG-DTIC-LP組4組，每組6只，雌雄各半。于第1、3、5、7、9天按10 mg/kg給藥劑量給生理鹽水組小鼠尾靜脈注射生理鹽水，空白脂質體組尾靜脈注射空白脂質體混懸液，DTIC溶液組尾靜脈注射1mg/mL DTIC溶液，PEG-DTIC-LP組尾靜脈注射1 mg/mL PEG-DTIC-LP混懸液。以腫瘤體積、小鼠體重、小鼠存活天數為指標，評價PEG-DTIC-LP的抗腫瘤效應，并與其余各組進行比較。從治療第一天開始隔天一次測量小鼠腫瘤體積和小鼠體重。從腫瘤細胞接種日期(day 0)算起，統計小鼠存活天數，繪制各組小鼠的生存曲線圖。

2 結果

2.1 PEG-DTIC-LP性質表征

2.1.1 包封率和載藥量 硫酸銨梯度法制備的PEG-DTIC-LP包封率為(60.41±2.47)%，載藥量為(5.95±0.24)%。

2.1.2 外觀及形態 肉眼觀察下PEG-DTIC-LP混懸液呈質地均勻、半透明、有亮藍光澤的乳白液體。在透射電鏡下呈球形，外觀圓整，見圖1。

圖1 PEG-DTIC-LP透射電鏡圖

2.1.3 粒徑分布及Zeta電位 Malvern Zetasizer Nano ZS90粒度儀測得PEG-DTIC-LP的粒徑呈近似正態分布，平均粒徑為190nm，多分散指數(polydispersity index，PDI)為0.184，Zeta電位-53.8 mV，見圖2。

圖2 PEG-DTIC-LP粒徑分布直方圖

2.1.4 穩定性考察 4℃條件下，7天內PEG-DTIC-LP混懸液的外觀無明顯變化；放置14天后，亮藍色乳光消失。28天包封率變化為：0天(60.41±2.47)%、7天(59.15±0.98)%、14天(55.66±0.69)%、21天(51.03±2.09)%、28天(33.10±0.29)%，可見放置7天后PEG-DTIC-LP包封率無顯著變化(P>0.05)，由60.41%下降為59.15%，放置14天后包封率下降為(55.66±0.69)%(P<0.05)。

2.1.5 體外釋放研究 PEG-DTIC-LP在PBS 6.5和PBS 7.4中的藥物累積釋放曲線，PEG-DTIC-LP在兩種釋放介質中均呈現一定緩釋特性，在弱酸性環境PBS6.5中呈現出更高的藥物釋放率，見圖3。

圖3 達卡巴嗪長循環脂質體體外釋藥曲線圖

2.2 PEG-DTIC-LP體內抗腫瘤效應

2.2.1 各組荷瘤小鼠腫瘤體積變化比較 給藥后第18天，PEG-DTIC-LP組小鼠腫瘤體積為(696.63±536.82)mm3，顯著小于DTIC溶液組(5128.93±1120.49)mm3和生理鹽水組(3174.46±1160.98) mm3(P<0.05)，小于空白脂質體組(1771.39±909.04 )mm3，但差異無統計學意義(P>0.05)，見圖4。

圖4 荷瘤小鼠腫瘤體積變化

2.2.2 各組荷瘤小鼠給藥后體重變化 空白脂質體組、生理鹽水組和DTIC溶液組的荷瘤小鼠給藥后體重變化曲線基本重合，三組比較差異無統計學意義(P>0.05)。PEG-DTIC-LP組荷瘤小鼠平均體重低于其余三組(P<0.05)，原因可能是該組小鼠給藥后黑色素瘤生長速度顯著減小，使瘤體重量小于其余各組，見圖5。

圖5 荷瘤小鼠體重變化

2.2.3 荷瘤小鼠生存時間 各組荷瘤小鼠中位生存時間長短分別為：PEG-DTIC-LP組為35天，DTIC溶液組為26天，空白脂質體組為31天，生理鹽水組為29天，即PEG-DTIC-LP組>空白脂質體組>生理鹽水組>DTIC溶液組(P<0.05)，見圖6。

圖6 荷瘤小鼠生存曲線圖

3 討論

本實驗制備的PEG-DTIC-LP平均粒徑為190nm，研究表明[24]粒徑小于200nm，有利于脂質體進入血管內皮細胞間隙，滲透進入病灶組織發揮藥效。

體內藥效學實驗結果顯示，PEG-DTIC-LP組荷瘤小鼠給藥后腫瘤體積最小，中位生存時間最長，初步證明PEG-DTIC-LP療效顯著優于DTIC溶液。但令人意外的是，相比生理鹽水和空白脂質體兩個空白對照組，DTIC溶液組小鼠中位生存時間最短，腫瘤體積最大，造成該結果原因可能有三點：①小鼠樣本量偏少。本來實驗最初預定的是每組10只小鼠，由于構建黑色素腫瘤模型過程中，部分小鼠建模失敗和死亡，最終篩選出建模成功、體重和腫瘤大小接近的荷瘤小鼠24只，每組6只，造成實驗樣本量小，實驗結果誤差偏倚較大，這是本實驗的遺憾和不足。②普通DTIC制劑自身有效率偏低，1998-2006年4個Ⅲ期多中心隨機對照研究顯示DTIC單藥有效率僅為7.5%～12.2%[25]。③DTIC游離藥物細胞毒作用強，使小鼠給藥后存活時間較短。

4 結論

本實驗研究結果提示，將DTIC制備成長循環脂質體有利于提高其抗腫瘤效應。