2種植物體內NO3-含量檢測方法的比較*

劉 飛 張立濤 申 彤 張家豪 劉祎良 徐國豪 徐 娜

（濟寧醫學院生物科學學院 山東日照 276826）

實驗教學是植物生理學教學工作中必不可少的一部分。將實驗與教學有機結合，有助于學生充分理解理論知識，提高學習效率，積極運用基礎知識，達到學以致用的教學效果[1-2]。隨著科學技術的快速發展，用于科研工作的儀器也日益先進且自動化，將學科和科技前沿引入到實驗教學中，可提高學生把握科技脈絡的能力，不斷創新，與時俱進[3]。

氮素是生命體內蛋白質、核酸、磷脂等多種有機體的重要組成成分，參與生命體內物質與能量的代謝過程，被譽為“生命的元素”[4]。氮素是植物體生長發育所必須的大量元素，植物缺氮會造成植株矮小，葉片發黃，最終會影響作物的產量[5]。

土壤中存在NO3-、NO2-、NH4+、含氮有機物等多種形式的氮素，而多數陸生植物，例如，小麥、玉米等都是以吸收NO3-作為主要的氮源，因此，植物吸收利用NO3-的能力對植物的生長發育具有重要的作用[6]。植物體內NO3-的積累量（NO3-含量）是衡量植物對NO3-吸收利用能力的一個關鍵的指標，因此，需要一種快速有效地測定植物體內NO3-含量的方法。目前，植物體內NO3-含量的測定方法主要有2 種，分別為水楊酸濃硫酸比色法[7]和硫酸肼還原并流動分析儀法。為比較2 種NO3-含量測定方法的優、缺點，筆者以10 mmol/L NO3-處理不同時間的擬南芥幼苗為樣品，采用2 種方法對樣品內的NO3-含量進行測定，發現流動分析儀法具有省時、省力、安全系數高、測定樣品量大、數據穩定性好、易于操作等優勢。

1 材料與方法

1.1 實驗材料準備 將野生型擬南芥在琥珀酸銨培養基上培養生長7 d，用10 mmol/L KNO3分別處理0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h，每個處理設置3 個生物學重復，取全苗作為實驗樣品，共15個樣品。

1.2 NO3-提取 取所需測定的擬南芥全苗材料（約20 株，不超過0.1 g）于1.5 mL 離心管中，稱重，液氮冷凍研磨，加入1 mL ddH2O，100℃煮沸30 min，13 000 r/min 離心10 min，取上清液作為所需測定的樣品。

1.3 實驗方法

1.3.1 水楊酸-濃硫酸比色法 2017年Zhao 和Wang[7]發表的文章中詳細介紹了硝態氮含量測定方法。該方法以氮濃度為橫坐標，光密度為縱坐標，繪制標準曲線并計算出回歸方程為C（μg/mL）=140.86×OD410-1.1831。利用標準曲線所得的回歸方程計算出NO3--N 濃度，再用以下公式計算樣品中的NO3--N 含量。NO3--N 含量=C*V/W，式中：C 為回歸方程計算的NO3--N 濃度，V 為提取樣品液總量，W 為樣品鮮重。

1.3.2 硫酸肼還原并流動分析儀法

1）配制溶液。KNO3標準溶液、0.1%硫酸銅儲備液、1%硫酸鋅儲備液。

顯色劑：稱取2 g 磺胺溶于120 mL ddH2O 中，加入0.1 g NEDD（N-甲萘基鹽酸二氨基乙烯）混合均勻，然后加入20 mL 磷酸，定容至200 mL，儲存于棕色瓶中。

氫氧化鈉溶液：稱取10 g 氫氧化鈉溶于600 mL ddH2O 中，小心地加入3 mL 磷酸并混合均勻，定容至1 L 并加入1.36 mL 22%的Brij-35 溶液。

硫酸肼溶液：稱取0.4 g 硫酸聯胺溶于120 mL ddH2O 中，加入2 mL 硫酸銅儲備液和2 mL 硫酸鋅儲備液，定容至200 mL。

2）流動分析儀檢測樣品NO3-含量。標準曲線測定樣品準備。分別吸取4 mL KNO3標準溶液至樣品管中，用于使用流動分析儀（AA3）制作標準曲線。

樣品測定準備。吸取0.8 mL 樣品液至樣品管中，然后加入3.2 mL ddH2O，混勻。

流動分析儀上機測定。將上述樣品管置于樣品架上，將吸管插入相應的試劑中，按照流動法分析儀的操作步驟操作，檢測樣品中NO3-的含量。

2 實驗分析與討論

2.1 實驗操作分析 實驗效率是衡量實驗方法的一個關鍵指標，在有多種選擇的條件下，應選擇耗時少、效率高的實驗方法。本實驗對2 種NO3-提取的方法——水楊酸濃硫酸比色法和硫酸肼還原并流動分析儀法進行了比較。從實驗操作步驟上比較，水楊酸濃硫酸比色法需要配制試劑、測定并繪制標準曲線、樣品液與試劑反應、比色等步驟，實驗操作繁瑣，耗時長；而硫酸肼還原并流動分析儀法只需準備試劑，然后上機檢測，整個過程包括標準曲線和樣品的測定均實現了全自動化，操作步驟簡易，極大提高了實驗效率。2.2 樣品測定量分析 樣品測定量是影響實驗效率的一個重要因素。從測定樣品的數量上比較，水楊酸濃硫酸比色法需要研究者自己操作，并且為了減小操作誤差，一般每個樣品會做3 個技術重復，這就使得該法一次能檢測的樣品數量受限，因此，該法適用于樣品量少的情況。硫酸肼還原并流動分析儀法采用機器取樣、反應、比色自動化的檢測形式，縮短了樣品檢測的時間，并且實現了樣品檢測的連續性，使得該法測定樣品的數量極大增加，提高了實驗效率，因此，該法適用于大批量樣品檢測的情況。

2.3 安全性分析 實驗室安全一直是研究者關注的焦點。由于實驗需求，實驗過程中可能會使用一些有毒或強酸、強堿等危險試劑，這就要求研究者在實驗操作中做好防護，注意自身安全。此外，若實驗目的相同，但存在多種實驗方法時，在實驗結果不受影響的條件下，一般選擇安全系數高的實驗方法。由于水楊酸濃硫酸比色法需要使用大量的濃硫酸，該方法存在較大的安全隱患，在有條件的情況下，盡可能選擇硫酸肼還原并流動分析儀法。

2.4 數據穩定性分析

2.4.1 實驗結果 將15 個樣品磨碎、煮沸后制備NO3-提取液。然后利用水楊酸法濃硫酸比色法對樣品中的NO3-含量進行檢測，每個樣品設置3 個技術重復。利用分光光度計得到每個樣品的OD410值，根據1.3.1 中的公式，可計算出每個樣品中的NO3--N濃度C（μg/mL），并得出最終的NO3--N 含量（μg/g），結果如表1 所示。

表1 水楊酸法濃硫酸比色法結果

吸取每個樣品的NO3-提取液0.8 mL 至3.2 mL ddH2O 中，將提取液稀釋5 倍，按照流動分析儀操作步驟操作，每個樣品設置重復吸取3次，即為3個技術重復。由于流動分析儀可自動獲得標準曲線，其所輸出的結果為所測溶液的NO3--N 濃度C（μg/mL），則利用1.3.1 中的公式可計算出樣品的NO3--N 含量（μg/g），所得結果如表2 所示。

表2 硫酸肼還原并流動分析儀法結果

2.4.2 數據穩定性分析 計算不同方法測定的每個樣品的3 個技術重復的標準偏差（圖1、表3），結果顯示硫酸肼還原并連續流動分析儀法的標準偏差顯著小于水楊酸濃硫酸比色法。流動分析儀法是系統自動化操作，誤差率較低，而水楊酸濃硫酸比色法需要人工操作，實驗過程中存在待測液吸取誤差、試劑吸取誤差、反應時間控制誤差等一系列不可控的人工操作誤差，使其誤差率偏大，表明連續流動分析儀法的技術重復性好，數據穩定性高，保障結果更加精準。

圖1 2 種NO3-測定方法的數據穩定性分析

表3 2 種NO3-測定方法的數據穩定性分析（單位：μg/g）

3 結語

隨著科學技術的快速發展，越來越多的高精尖儀器用于科研工作中，極大提高了實驗效率，降低了實驗過程中的危險性，并且能保障實驗結果的精確性和穩定性。由上述2 種植物體內NO3-含量測定方法的比較可知，相對于傳統的水楊酸濃硫酸比色法，硫酸肼還原并流動分析儀法具有省時、高效、安全性高、穩定性好等優勢，是目前NO3-含量檢測的理想方法。