裝載α-生育酚的乳木果油固體脂質納米顆粒的制備與表征

楊 振，李 曼，慕鴻雁，熊 柳，孫慶杰*

（青島農業大學食品科學與工程學院，山東 青島 266000）

在過去的20 a不同類型的脂質納米顆粒逐漸成為研究熱點，包括固體脂質納米顆粒（solid lipid nanoparticle，SLN）、納米結構脂質載體、脂質藥物結合物、脂質納米膠囊[1]。重要的是，SLN已被引入脂溶性活性物質的載體，并發展作為乳液、脂質體和聚合物納米顆粒的替代載體[2]。SLN的粒徑范圍通常為50～1 000 nm。SLN是由乳化劑穩定的固體脂質組成的納米顆粒[3]。與其他的載體相比，SLN展示了靶向藥物遞送[4]、藥物的控釋和緩釋[5]、增強藥物的穩定性[6]和改善藥物溶解度的潛力[7]。與以前的油基乳液相比，SLN的脂質狀態在室溫條件下呈現固態[8]，SLN的脂質成分可以是高純化的脂肪酸、甘油三酸酯或脂肪酸和甘油三酸酯的混合物[9]。前期研究表明，SLN通常用于包埋生物活性物質[10]。在SLN中生物活性物質的包封有利于保護生物活性物質免受由外部因素（如熱、酸和氧）引起的降解損失[11]。此外，SLN的制備是基于通過高剪切均質或超聲處理得到的固化納米乳液技術，因此，通常認為SLN安全[12]。而且，SLN比脂質體具有更高的穩定性，并且能夠與親脂性的藥物相結合。另外，SLN的制備能夠進行大規模生產[13]。

目前制備SLN的方法較多，如溶劑乳化或蒸發、超聲或高速均質以及乳液的超臨界萃取，其中最重要的是高速均質化的制備方法。用于制備SLN的脂質包括蠟、類固醇、甘油單酸酯、甘油二酸酯、甘油三酸酯和脂肪酸。Hashem等[14]使用硬脂酸和甘油單硬脂酸酯復合作為脂質基質成功制備用于裝載脂溶性藥物的SLN。Botto等[15]利用雙硬脂酸甘油酯（Precirol ATO 5）作為脂質基質制備了用作基因治療的非病毒載體的SLN。Baek等[16]使用硬脂酸制備了用于裝載漢黃芩素的SLN。而且，研究報道了2 種或多種不同種類的脂質組分已用于制備SLN。Dantas等[17]利用硬脂酸與蠟質作為脂質成分制備了SLN。另外，Xie Shuyu等[18]利用3 種脂肪酸（棕櫚酸、十四酸和硬脂酸）作為一種脂質基質成功制備了用于包埋活性物質的SLN。總之，當前大多數研究通過使用一種或多種脂質成分制備SLN。然而，這些脂質通常用于非食品領域中，并且具備不可食用的缺點。植物油脂由于其固有的生物降解性和低毒性通常認為是綠色安全的。但是植物油脂在室溫下呈液態，因此很難用于制備SLN。鑒于先前研究中制備的SLN并非食品級，所以利用植物油制備SLN在食品領域非常重要。

從酪酯樹的種子中提取的乳木果油被廣泛用于西非和中非的食品、化妝品以及制藥業中[19]。乳木果油是純天然的綠色植物脂肪固體資源，由于乳木果油組分中存在酚類化合物，使其具有促進表皮細胞再生、抗氧化和抗炎癥的功效[20-21]。由于乳木果油在室溫條件下表現出固態相性質，所以在本研究中使用乳木果油作為固體脂質基質原料開發食品級SLN。

本研究以乳木果油為原料，通過采用高速剪切均質的方法制備不同油水比例的SLN。本實驗中該制備方法的優點是過程簡單、制備時間短（均質時間）以及基于較少的時間和材料具備大規模生產制備的潛力。該方法不同于在其他研究中報道的復雜制備方法[22-23]。在許多研究中SLN的制備是通過熱剪切均質技術結合超聲處理方法，通常需要較長的時間，包括均質時間、超聲時間和緩慢冷卻時間。這些新開發的食品級SLN將在食品、制藥和生物醫學行業中找到潛在的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳木果油 上海千峰化工有限公司；α-生育酚上海賢鼎生物科技有限公司；吐溫20、吐溫80 德國默克試劑公司；十三酸甲酯（純度＞99%）和52混合標準品（C4～C22） 西格瑪奧德里奇化學公司；其余所用試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

8890GC氣相色譜儀 美國安捷倫科技公司；D8-ADVANCE X射線衍射儀 德國布魯克AXS有限公司；LXJ-IIB離心機 上海安亭儀器公司；DSC1差示掃描量熱儀 美國梅特勒-托利多公司；FJ-200高速均質機紹興上虞艾科儀器設備有限公司；ZSP動態光散射儀馬爾文儀器有限公司；7650透射電子顯微鏡 日本日立公司；TU-1810紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳木果油的氣相色譜分析

甲基化步驟：采用兩步甲基化方法，并進行修改[24]。首先，將乳木果油加熱至40 ℃融化，之后將3 滴樣品加入15 mL試管中，然后在40 ℃恒溫條件下保持靜置。向試管中添加4 mL的異辛烷，將其充分搖勻，然后靜置2 min。之后將0.2 mL含有氫氧化鉀的甲醇溶液加入上述混合物中，混勻保持靜置2 min。從試管中取出1 mL上清液用于測定。

氣相色譜條件：色譜柱：聚二氰丙基硅氧烷強極性固定相（100 m×0.25 mm，0.2 μm）；程序升溫：初始溫度150 ℃，保持1 min，以1.5 ℃/min升溫至220 ℃，之后保持1 min；檢測器溫度250 ℃；以氫作為燃料氣體，流速100 mL/min；氮氣用作載氣，流速15 mL/min；尾氣流速15 mL/min。脂肪酸測定分析基于制造商提供的等效鏈長值以及不同標準品所獲得保留時間。通過高純度標準品分離出不同脂肪酸。

1.3.2 X射線衍射

乳木果油的結晶結構通過X射線衍射儀測定。掃描速率1°/min，掃描范圍0°～60°。乳木果油的相對結晶度是通過在衍射圖上繪制峰的基線并通過使用JADE 5.0計算面積確定。相對結晶度按式（1）計算[25]：

式中：A1為X衍射曲線特征峰面積；A2為X衍射曲線上峰的總面積。

1.3.3 SLN的制備

乳木果油SLN通過高速熱均質的方法制備[26]。乳木果油在高于其熔點溫度（36.20 ℃）的60 ℃條件下融化。在相同溫度下，吐溫80或吐溫20加入去離子水中溶解作為水相。然后，將水相加入脂相中，使用高速均質機以10 000 r/min均質3 min形成O/W的乳液。將獲得的SLN在4 ℃進行固化貯存。另外，α-生育酚添加到脂質相中，包埋α-生育酚的SLN通過相同制備過程得到。制備不同SLN方案如表1所示。

表1 SLN和包埋α-生育酚SLN的制備配方Table 1 Formulations of SLNs and α-tocopherol-loaded SLNs%

1.3.4 顆粒粒徑的測定

參照吳紅艷等[27]的方法，使用動態光散射儀測定分析乳木果油SLN的平均顆粒粒徑、聚合物分散指數（polymer dispersity index，PDI）和粒徑分布。使用去離子水將SLN懸浮液稀釋20 倍，以避免多重散射效應影響測定結果。在室溫25 ℃條件下進行測定分析。

1.3.5 透射電子顯微鏡

參照Ge Shengju等[28]的方法，使用超純水將制備得到的SLN懸浮液稀釋20 倍，之后取一滴稀釋后的SLN懸浮液沉積在300 目的碳涂層銅網上。濾紙除去多余的液體，然后通過真空凍干以獲得樣品。透射電鏡的加速度電壓為80 kV。

1.3.6 差示量熱掃描儀測定

參照馮艷等[29]的方法，使用差示量熱掃描儀測定乳木果油的融化參數（如融化溫度和融化焓值）。差示量熱掃描儀在30 mL/min的氮氣下運行，并使用空的小鋁鍋作為空白對照。差示量熱掃描的校準方法是通過手動校準，包括基線優化、熔爐的校準、樣品溫度的校正、自動掃描和熱流校準[29]。乳木果油和固化后的SLN懸浮液加入到鋁鍋中，然后密封。掃描的溫度范圍和速率分別為0～100 ℃和10 ℃/min。通過軟件STARe分析記錄差示量熱掃描圖中的起始溫度（To）、峰值溫度（Tp）和終值溫度（Tc）。SLN的融化焓值（ΔH）是通過峰下基線與熱譜圖之間的面積積分進行計算，單位為J/g。

1.3.7 包封率和載藥量的測定

參照Ali等[30]的方法，測定α-生育酚在乳木果油的SLN中的包埋率和載藥量。將3 gα-生育酚添加到30 g融化的液態脂質中，接著按照上述制備步驟形成SLN后將SLN懸浮液離心（3 500×g，10 min），離心后收集上清液，并取1 mL稀釋10 倍進行分析。分光光度計的波長設置為285 nm。按式（2）、（3）計算α-生育酚的包埋率和載藥量[30]：

式中：C1為總α-生育酚質量/g；C2為未包埋的α-生育酚質量/g；M1為α-生育酚包埋量/g；M2為SLN中的α-生育酚質量/g。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 乳木果油的脂肪酸組成

如表2所示，乳木果油是由多不飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸組成。乳木果油中的飽和脂肪酸主要由棕櫚酸（C16:0）、硬脂酸（C18:0）和花生酸（C20:0）組成。其中，硬脂酸的含量占全部脂肪酸的40.61%。不飽和脂肪酸主要由高含量的油酸（C18:1，45.47%）和少量的亞油酸（C18:2，7.33%）組成。乳木果油中高濃度的硬脂酸賦予乳木果油在室溫呈現固態的物理特性，這有利于SLN的制備。而且，各種脂肪酸的存在有利于SLN中疏水活性成分的裝載。實驗結果與相關研究報道一致[31]，硬脂酸和油酸是主要的組成成分。

表2 氣相色譜測定的乳木果油脂肪酸組成Table 2 Fatty acid composition of shea butter measured by gas chromatography

如圖1所示，乳木果油的X射線衍射圖譜表現出主要的衍射峰和結晶相，符合不同脂肪酸的特征。其中，在2θ為21°處的衍射峰屬于硬脂酸[32]。此外，乳木果油的X射線衍射圖譜有較短的晶間距（4.2 ?和3.8 ?），這種β’多態性的特征表明脂質中存在大量的棕櫚酸[32]。乳木果油圖譜中存在的寬峰范圍（12°～22°）是因多種脂肪酸結合導致，這也與脂肪酸的組成測定結果一致（表2）。乳木果油含有多種脂肪酸，具備穩定的結晶多態性形態。而且，SLN的X射線衍射圖譜在21°處出現強峰，這可能是由于SLN存在硬脂酸的原因。圖譜中在23.7°處弱峰的存在是因為在SLN表面有吐溫系列的乳化劑[33]。

圖1 乳木果油（A）和SLN（B）的X衍射圖Fig.1 X-ray diffraction patterns of shea butter (A) and SLNs (B)

如圖2所示，乳木果油在36.20 ℃出現吸熱峰。差示量熱掃描儀的吸熱峰表示乳木果油結晶的熔化。與硬脂酸（69 ℃）和棕櫚酸（63 ℃）等固體脂肪酸相比，乳木果油的熔融溫度更低[33]。乳木果油的熔點與結晶度一致（圖1），而且乳木果油的低融化溫度是由于組分中含有多種脂肪酸的混合物（表2）。

圖2 乳木果油的差示掃描量熱圖Fig.2 Differential scanning calorimetric thermogram of shea butter

2.2 SLN的粒徑與形貌

根據不同的油水比（1∶9～1∶1），選擇吐溫80或吐溫20作為乳化劑，制備5 種O/W的乳液。將得到的脂質納米顆粒乳液在4 ℃固化以獲得SLN懸浮液。因為每種乳液都包含不同量的固體脂質，所以從液滴形成SLN所需的固化時間也不同。長期的低溫固化過程將使顆粒趨于聚集并且粒徑略有增大。乳化劑的負電荷能夠抑制顆粒的聚集。F1、F2、F3、F4和F5所需的最佳固化時間分別為240、60、30、30 min和40 min。固化時間的選擇取決于在相同的顆粒制備過程中不同固化時間獲得的最小SLN粒徑。如圖3所示，F1中乳液固化后，SLN懸浮液的粒度分布大于乳液的液滴分布。相反，具有更高脂質含量的F2和F3呈現出相反的趨勢。隨著乳木果油含量的不斷增加，乳液的液滴分布與F4和F5中SLN懸浮液的粒徑分布趨于一致。

圖3 固化前乳液的液滴分布和固化后懸浮液的顆粒分布Fig.3 Droplet size distribution of emulsions before curing and particle size distribution of suspensions after solidification

從表3可以看出，SLN的平均粒徑隨乳木果油的含量增加而逐漸減小。其中，F5中的SLN具有最小的粒徑（30.43 nm），而F1中的SLN具有最大的粒徑（278.17 nm）。選擇合適的乳化劑會影響所形成的SLN粒徑大小。吐溫80的親水親油平衡值（hydrophile lipophile balance，HLB）為15.0，這低于吐溫20的HLB（16.7）。更低的HLB代表乳化劑有更強的油脂親和力。因此，吐溫80被加入到油相含量更高的乳液中[34-35]。所有制備得到的SLN都顯示出相似的PDI，這表明SLN的分散性良好。而且，SLN的Zeta電位顯示為負值，SLN的負Zeta電位有助于防止納米顆粒的聚集，從而通過靜電排斥增強了分散液的穩定性。相對低的PDI也表明了這一點。F7中的SLN粒徑小于F3配方的顆粒粒徑，主要是由于脂溶性活性物質α-生育酚裝載在SLN中，其可能與SLN中的脂質發生協同效應，這會進一步降低顆粒的粒徑和提高顆粒的穩定性[36]。另外，本研究中所制備的乳木果油SLN粒徑小于之前研究報道的SLN粒徑[22-23]。在Ali等[22]的研究中，SLN的粒徑范圍為141～152 nm。Hassan等[23]所制備的SLN粒徑范圍為84～1 624 nm。本研究中SLN的粒徑范圍為30.43～278.17 nm，可以通過調整制備條件獲得不同粒徑的SLN。

表3 SLNs和包埋α-生育酚SLNs的粒徑、PDI和Zeta電位Table 3 Particle sizes, PDI, and zeta potentials of SLNs and α-tocopherol-loaded SLNs

為了更清晰地了解SLN的形貌，使用透射電子顯微鏡分析乳木果油SLN的形態。如圖4所示，SLN近似球形并且形狀均勻。SLN的形狀與Penumarthi等[37]的研究中使用膽甾醇油酸酯、甘油三油酸酯和其他脂質制備的SLN一致。SLN的粒徑隨油相比重的增加而不斷減?。ū?）。高含量的油相在油水界面與乳化劑相互作用，能夠穩定更多的界面面積，從而降低界面張力和乳液液滴的粒徑[38]。另外，透射電子顯微鏡還顯示出SLN具有良好的分散性，這與表3中SLN的PDI（0.10～0.24）一致。

圖4 以不同油相比例制備的乳木果油SLNs的透射電子顯微鏡圖Fig.4 TEM images of shea butter SLNs prepared with oil phase fractions of 0.1 (A), 0.2 (B), 0.3 (C), 0.4 (D) and 0.5 (E)

2.3 SLN的熱特性

如表4所示，不同SLN的熱峰值溫度分別為24.43（F6）、19.05（F7）、19.23（F8）、28.96（F1）、27.08（F2）、22.5（F3）、22.42 ℃（F4）和22.75 ℃（F5），明顯低于乳木果油的熱峰值溫度（35.84 ℃）。天然乳木果油的差示量熱掃描儀結果與之前的實驗報道一致[30]。而且，與乳木果油的Tc-To范圍（14.0 ℃）相比，所有的SLN樣品都明顯降低（4.23～7.79 ℃）。此外，所有SLN的ΔH值（-0.68～-9.71 J/g）顯著低于乳木果油（-36.58 J/g）。同時隨著油相比例的增加，熱焓值顯著降低，這可能是更多脂質基質延遲了在冷卻過程中的重結晶行為。從F1到F3，峰值溫度趨于更低的溫度，這可能是由于粒度效應引起的。相關研究表明，隨著顆粒粒徑的減小，熔融轉變變寬并移向更低的溫度[38-39]。納米顆粒的熔融變化很大程度依賴于粒度的大小變化。顆粒的粒徑減小，熔點發生降低。另外，顆粒的比表面積越大，其熔融溫度峰值隨之降低[40]。圖5中吸熱峰能夠表明SLN的形成，說明在低溫固化的過程中發生了相態轉變和結晶結構的變化。熔點的略微下降表明脂質基質在形成SLN后無定形程度增加。

表4 乳木果油SLNs的熱特性Table 4 Thermal properties of shea butter SLNs

圖5 未包埋α-生育酚（F1～F5）及裝載α-生育酚（F8）的乳木果油SLNs的差示量熱掃描圖Fig.5 Differential scanning calorimetric thermograms of shea butter SLNs without (F1, F2, F3, F4 and F5) and with α-tocopherol (F8)

2.4 包埋率和載藥量結果

為了將α-生育酚完全裝載到SLN中，將占比10%的α-生育酚加入到脂質相中，并按照之前步驟測量離心后上清液中的游離α-生育酚，根據方程（2）和（3）計算SLN中α-生育酚的包埋率和載藥量。如表5所示，在F8中的α-生育酚的包埋率和載藥量分別為95.11%和9.6%。F8的結果高于F6和F7，這表明活性物質的包埋與裝載隨著乳木果油占比的增加而提高。相比較于之前的研究報道[41]，本實驗中α-生育酚的包埋率和載藥量數值更高。從表6也能夠看出，相比之前不同組分的SLNs，本實驗中對于活性物質的包埋率和載藥量數值更高。而且，α-生育酚在SLN中的包埋率為95.11%，高于文獻[40]結果。推測SLN中α-生育酚的高包埋率可能是由于SLN中的脂質相與脂溶性活性物質之間存在疏水相互作用。其中，脂質成分、固體性質以及納米顆粒等因素都會導致SLN中的α-生育酚包埋率較高。另外，乳木果油的脂質基質具有低結晶度，使部分無定形區域包埋脂溶性的物質。在SLN中，脂溶性活性物質α-生育酚包埋在油相中，油相由固態脂質包圍，對活性物質的泄露起到一定保護作用，從而提高了包埋率[36]。

表5 包埋率和載藥量Table 5 Encapsulation efficiency and loading content of α-tocopherol

表6 具備不同活性成分和脂質組成的SLN包埋率和載藥量Table 6 Encapsulation efficiency and loading content of different bioactive components in SLNs with different lipid compositions

3 結 論

在本研究中，第一次通過高速均質方法成功制備乳木果油SLN。油水比為5∶5的SLN粒徑和PDI分別為30.43 nm和0.21。從透射電子顯微鏡來看，SLN的形態呈現近似球形。差示量熱掃描的熱特性測定顯示出乳木果油SLN的形成，并且SLN的峰值溫度隨著粒徑減小而趨向更低的溫度。另外，脂溶性活性物質α-生育酚成功裝載到SLN中，并且包埋率達到95.11%。這項研究將為乳木果油在食品、化妝品以及生物醫學行業中的更廣泛應用提供理論依據。乳木果油SLN不僅可以裝載脂溶性活性物質或藥物，還能夠用作營養輸送的有益載體。