Streptomyces alboflavus TD-1產揮發性抑菌物質對黃曲霉菌生長及其毒素的抑制作用

張曉君，路來風，李淑華，王昵霏，李王強，王安琪，宋冠林，李貞景，王昌祿*

（省部共建食品營養與安全國家重點實驗室，天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457）

鏈霉菌產生的代謝產物具有免疫抑制、抗癌、抗真菌及細菌等多種功能[1-2]，在植物病害、儲糧及飼料防霉、抑制毒素等方面具有廣泛應用[3]。調控鏈霉菌一個重要的機制為碳分解代謝抑制。葡萄糖是一種可被快速利用的碳源，可以起到縮短菌體延滯期和促進菌體生長的作用[4]，碳源較多的培養基可延緩菌絲自溶，有利于合成代謝產物積累，反之，碳源稀薄則會導致菌絲早期自溶[5]。當碳源濃度過高，又會使許多化合物的成受阻[6]。Romero-Rodríguez等[7]發現，高濃度葡萄糖會抑制鏈霉菌在固體培養基上的孢子形成。只有在葡萄糖被消耗到一定程度，阻遏作用被解除時才開始合成次級代謝產物[8-9]。

微生物代謝產生的揮發性有機化合物（volatile organic compounds，VOCs）在控制病原菌方面有巨大潛力[10]，其分子質量低、可快速降解[11]，對植物病原菌顯示出良好的拮抗活性[12-13]。此外，利用食品級VOCs保護農作物和動物免受真菌病原體的侵害也受到廣泛關注[14]。已有研究發現，1-辛烯-3-醇和其他VOCs（如反式-2-己醛）是拮抗青霉菌和其他真菌的有效熏蒸劑[15-17]。作為一種食品級VOCs，1-辛烯-3-醇最初在真菌中發現，后來也在多種植物中發現[18-19]，是植物細胞反應、植物-食草動物相互作用和植物-植物相互作用的信號分子[20]，也是抑制絲狀真菌萌發的信號化合物[15]，但是，目前1-辛烯-3-醇作為一種揮發性信號化合物對其他真菌及其生理機制影響的研究并不深入。

黃曲霉（Aspergillus flavus）是一種常見霉菌，多存在于發霉的糧食及飼料中，部分黃曲霉菌還能產生黃曲霉毒素，其中黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）毒性最強。黃曲霉毒素對人類和家畜都有很強的毒性及致癌性。生物防治具有無污染、對人體健康無不良影響等優點，應用前景廣闊。因此，利用生物防治法預防糧食及飼料等發生霉變具有重要意義[21]。

本實驗以課題組早期從土壤中分離的白黃鏈霉菌TD-1（Streptomyces alboflavusTD-1）為拮抗菌，研究其在不同濃度葡萄糖培養基中的生長情況及其產生的VOCs對黃曲霉菌生長的影響，并對VOCs組分進行鑒定分析，篩選出一種食品級單體化合物1-辛烯-3-醇，對其拮抗黃曲霉的抑菌機理及抑制黃曲霉毒素合成的調控機制進行研究，旨在為微生物源VOCs在食品中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

拮抗菌：白黃鏈霉菌TD-1，本實驗室專利菌種。指示菌：黃曲霉，購于中國工業微生物菌種保藏管理中心（CICC 2219）。

1.1.2 培養基

鏈霉菌采用高氏一號改良MM培養基進行培養，其中，種子培養基為不加葡萄糖的MM培養基，接種量為10%，28 ℃培養48 h備用。

高氏一號改良MM培養基：黃豆粉5.0 g，K2HPO40.5 g，MgSO4?7H2O 0.2 g，FeSO4?7H2O 0.01 g，蒸餾水1 000 mL（固體培養基加2%瓊脂粉）。

將100 mL高氏一號改良培養基分裝到250 mL三角瓶中，使用時每瓶加入10 mol/L葡萄糖5.0、0.5、0.05 mL和0 mL，分別制成500、50、5 mmol/L和0 mmol/L濃度葡萄糖MM培養基，pH 7.0。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：將市售馬鈴薯洗凈、去皮，稱量200 g后切塊，加水煮沸20～30 min，8 層紗布過濾，向濾液中加入葡萄糖20 g，攪拌均勻，稍冷卻后加水至1 L，pH值自然，加入瓊脂30 g。

以上培養基滅菌條件為121 ℃、20 min。

1.1.3 試劑

羅丹明123、二甲基亞砜（均為分析純） 北京索萊寶生物科技公司；乙醇、甲醇、乙腈、二氯甲烷（均為分析純） 天津康科德科技有限公司；1-辛烯-3-醇（分析純） 天津索羅門生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海華線醫用核子儀器有限公司；HYG-IIa型迴轉式恒溫調速搖床上海欣蕊自動化設備有限公司；XMTD-1000型電熱鼓風干燥箱 天津市天宇實驗儀器有限公司；LRH-250-GII型恒溫培養箱 珠江廣東省醫療器械廠；Allegra X-30型臺式高速離心機 美國Beckman公司；1200型高效液相色譜儀 美國Agilent公司；QP2010 Ultral型氣相色譜-質譜聯用儀 日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄糖濃度對白黃鏈霉菌TD-1生長的影響

將含有不同濃度葡萄糖的MM培養基倒平板并晾干，等距離放置3 個直徑6 mm的濾紙片，吸取3 μL 1×107個/mL白黃鏈霉菌TD-1孢子懸浮液，滴于濾紙片上，立即用封口膜進行密封，28 ℃培養，在第3、5、7、10、12、14天采用十字交叉法測定菌落直徑。

1.3.2 葡萄糖濃度對白黃鏈霉菌TD-1生物量的影響

在含有不同濃度葡萄糖的MM培養基上平鋪一層已滅菌玻璃紙，吸取100 μL白黃鏈霉菌TD-1孢子懸浮液（106～108CFU/mL），均勻涂布于玻璃紙上，立即用封口膜進行密封，28 ℃培養10 d。將玻璃紙上的菌絲刮下，稱其濕質量，50 ℃烘箱中烘干，稱其干質量。

1.3.3 葡萄糖濃度對白黃鏈霉菌VOCs抑制黃曲霉菌生長的影響

采用雙皿對扣法[22]，吸取100 μL白黃鏈霉菌TD-1孢子懸浮液，均勻涂布于不同濃度葡萄糖平板上，制成下板；在上平板正中央放入一個直徑為6 mm的濾紙片，吸取3 μL黃曲霉孢子懸浮液，滴于濾紙片上，空白組（CK）下板為純培養基，不涂布鏈霉菌孢子懸浮液。將上下兩板對扣，28 ℃培養，觀察黃曲霉生長狀況。

1.3.4 不同濃度葡萄糖培養白黃鏈霉菌TD-1產生VOCs的氣相色譜-質譜分析鑒定

采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術，對含有不同濃度葡萄糖的白黃鏈霉菌TD-1液態發酵過程中產生的VOCs進行收集和鑒定。在第0、2、4、6、8天進行取樣。參照Yang Mingguan等[23]方法，取5 mL白黃鏈霉菌TD-1發酵液，放入頂空進樣瓶中進行VOCs吸附及氣相色譜-質譜分析。

1.3.5 1 -辛烯-3-醇對黃曲霉產孢能力和生長情況的影響

采用雙皿對扣法[22]測定揮發性單體物質對黃曲霉的抑制作用，略作修改：在培養基中央放置一個直徑為6 mm濾紙片，吸取3 μL黃曲霉孢子懸浮液，滴于濾紙片上；取1-辛烯-3-醇放置在另一個皿底中，迅速將兩皿對扣，用雙層封口膜進行密封，28 ℃培養5 d，采用十字交叉法測量各菌落直徑，用體積分數0.05% Tween 80溶液洗下黃曲霉孢子，用血球計數板計數各組黃曲霉孢子數量。以添加同體積無菌水進行對扣，作為空白對照實驗，進行3 次平行，重復操作3 次。

按照式（1）計算對黃曲霉生長抑制率，按式（2）計算對黃曲霉產孢抑制率：

1.3.6 1 -辛烯-3-醇對黃曲霉孢子和菌絲體微觀形態的影響

按照Li Qian等[24]方法，用掃描電子顯微鏡觀察1-辛烯-3-醇處理后黃曲霉孢子和菌絲體微觀形態的變化。

1.3.7 1 -辛烯-3-醇對黃曲霉線粒體膜電位的影響

采用羅丹明123染色法檢測1-辛烯-3-醇處理后黃曲霉線粒體膜電位的變化[25-26]。吸取100 μL黃曲霉孢子懸液（1×105CFU/mL），均勻涂布在PDA培養基中，將已經滅菌的蓋玻片以45°角插入培養基中，28 ℃預培養36 h，暴露在10 μL/L的1-辛烯-3-醇環境中12 h和24 h，用鑷子將插入的蓋玻片夾出，將10 μmol/L羅丹明123溶液與菌絲體混合，在黑暗條件下37 ℃孵育30 min，用磷酸鹽緩沖液洗滌3 次載玻片，吸干水分，在倒置熒光顯微鏡下進行觀察。

1.3.8 1 -辛烯-3-醇對AFB1生物合成的影響

黃曲霉的培養同1.3.6節黃曲霉菌絲體的培養方法。

AFB1的提?。河么蚩灼鳎? mm）打取5 個長滿黃曲霉菌絲體的瓊脂塊，用15 mL二氯甲烷浸提，室溫下振動30 min，將提取液吸出，重復2 次，合并提取液，3 000 r/min離心10 min，用真空濃縮儀濃縮干燥，加入1 mL流動相（乙腈-甲醇-水（1∶1∶2，V/V））溶解凝結物，用0.22 μm濾膜過濾，待測。

參照宋文靜[27]的方法測定AFB1。

1.4 數據處理與分析

結果采用SPSS 18.0軟件進行顯著性差異分析，P＜0.05，差異顯著。所有數值均以±s表示，采用Origin 9.0進行作圖。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖濃度對白黃鏈霉菌生長的影響

控制碳源含量是許多微生物優化發酵和控制培養條件的關鍵[28]。白黃鏈霉菌TD-1在葡萄糖濃度分別為0、5、50、500 mmol/L及N-乙酰-D-葡萄糖胺培養基中生長情況如圖1所示。在葡萄糖濃度增加的情況下，TD-1的生物量都呈現增長趨勢。在濃度為500 mmol/L時，其濕質量為247.1 mg，干質量為55.6 mg。TD-1在高氏一號改良MM培養基（未添加葡萄糖）生長的菌落直徑最大，隨著時間的延長其菌落逐漸變大，在10～14 d時直徑變化不明顯，且菌落開始變黑。隨著葡萄糖濃度逐漸增大，菌落直徑呈現下降趨勢，較無葡萄糖小，第7天以后鏈霉菌菌斑變厚，濃度為500 mmol/L時，TD-1菌落在發酵后期最厚且無發黑現象，添加N-乙酰-D-葡萄糖胺的效果沒有添加葡萄糖效果好。說明添加速效碳源有利于鏈霉菌生長，且可以減少其自溶現象。

圖1 葡萄糖濃度對白黃鏈霉菌TD-1生長的影響Fig.1 Effects of different concentrations of glucose on the growth of S.alboflavus TD-1

2.2 葡萄糖濃度對白黃鏈霉菌產VOCs抑制黃曲霉菌能力的影響

如圖2A所示，與CK相比，白黃鏈霉菌TD-1對黃曲霉的抑制作用極為明顯，其菌絲體及孢子較少，對扣過程中其孢子和菌絲體沒有掉落在對扣板上，CK掉落在對扣板上的菌絲體和孢子較多。葡萄糖濃度為0、5 mmol/L時，黃曲霉孢子產生的相對較多，菌絲體較少，50、500 mmol/L的孢子較少，菌絲體較多，說明葡萄糖濃度越高白黃鏈霉菌TD-1產生的VOCs對黃曲霉孢子萌發的抑制作用越強，50、500 mmol/L產生的VOCs抑菌能力較0、5 mmol/L強。

由圖2B可知，TD-1在高氏一號改良MM培養基（即葡萄糖濃度為0 mmol/L）培養時，開始產生的揮發性成分較其他濃度高，但總峰面積增幅較小，在第8天時明顯減少，葡萄糖濃度為5 mmol/L時產生的揮發性成分相對其他濃度較少，但一直呈現增長趨勢；葡萄糖濃度為50 mmol/L時，在0～4 d的揮發性成分產量大幅增加，在第4天達到最高值，但后期明顯下降；葡萄糖濃度為500 mmol/L時，0～2 d產揮發性成分少，但在2～4 d揮發性成分增長幅度明顯升高，4 d以后產揮發性成分較為穩定，且超過50 mmol/L時VOCs產量為4 種葡萄糖濃度中最高。說明葡萄糖濃度過高在發酵初期有分解代謝阻遏，到后期高濃度的葡萄糖為菌體的生長提供了豐富的碳源和能量來源，延緩了菌體的自溶，為代謝產物的生物合成提供了保障。

圖2 葡萄糖濃度對白黃鏈霉菌TD-1產生的VOCs抑制黃曲霉能力（A）及產VOCs總峰面積（B）的影響Fig.2 Influence of different glucose concentrations on anti-A.flavus effect (A) and total peak area of VOCs produced by S.alboflavus TD-1 (B)

2.3 不同濃度萄糖培養下白黃鏈霉菌TD-1 VOCs的組分鑒定

由圖3可知，共鑒定出60 種主要VOCs，包括酸類、酮類、醇類、醛類、醚類、呋喃類、萜烯類、烷烴類等物質。其中，部分烷烴類物質，包括1,2-環氧庚烷以及二十一烷含量等隨著發酵時間的延長、葡萄糖濃度的增加總體降低；醛類物質包括己醛、(Z)-2-庚烯醛、苯甲醛等含量隨著發酵時間的延長而降低，然而，隨著葡萄糖濃度的增加，部分酮類物質2,3-丁二酮、乙偶姻隨著葡萄糖濃度的增加含量逐漸增加；部分醇類物質異丁醇、正己醇、1-辛烯-3-醇、苯乙醇等物質隨著發酵時間的延長，含量大體呈現增長趨勢，其中1-辛烯-3-醇最為明顯；萜烯類物質2-甲基異冰片隨著發酵時間的延長含量大體呈現先增加后減少的趨勢。隨著葡萄糖濃度的增加，醚類物質如苯甲醚、二甲基三硫醚含量隨著發酵時間的延長略有增加。在VOCs組分中，乙酸、異丁酸、己醛、甲氧基-苯基肟、1-辛烯-3-醇、3-辛酮、2-正戊基呋喃、2-乙基-1-己醇、2-甲基異冰片、1,4-甲基-1H-環戊噠嗪、6-亞甲基-螺環癸烷、二甲萘烷醇（土味素）、異長葉烯-8-醇、二十一烷等含量較多。乙酸、己醛、1-辛烯-3-醇、2-正戊基呋喃、2-甲基異冰片、苯乙酮均具有一定的抑菌作用[29-32]。其中己醛、1-辛烯-3-醇具有抑制菌絲生長以及孢子萌發的作用，且1-辛烯-3-醇含量與抑制率具有相似的變化趨勢，具有作為食品添加劑使用安全的特性。因此，將1-辛烯-3-醇作為起主要抑菌作用的揮發性物質，對其進行抗黃曲霉活性以及對黃曲霉毒素合成調控的深入研究。

圖3 白黃鏈霉菌TD-1發酵過程中VOCs的熱圖Fig.3 Heatmap showing dynamic changes of VOCs from S.alboflavus TD-1

2.4 1-辛烯-3-醇對黃曲霉產孢能力和生長情況的影響

1-辛烯-3-醇含量梯度為0、5、10、15、20、25 μL/L，對黃曲霉進行抑菌活性測定，結果如表1所示。不同含量1-辛烯-3-醇對黃曲霉生長、產孢抑制率結果如圖4所示。在1-辛烯-3-醇含量為5～25 μL/L時，對黃曲霉均具有明顯的拮抗作用，生長抑制率在24.94%～100%之間，產孢抑制率在84.50%～100%之間。隨著1-辛烯-3-醇含量的增加抑菌活性逐漸增強，15 μL/L時可完全抑制黃曲霉菌的生長及孢子萌發，10 μL/L時其幾乎沒有孢子，產孢抑制率可達到99.85%，生長抑制率達到75.29%。

圖41 -辛烯-3-醇含量對黃曲霉生長、產孢抑制率的影響Fig.4 Inhibitory effects of different concentrations of 1-octen-3-ol on the hyphal growth and spore germination of A.flavus

2.5 1-辛烯-3-醇對黃曲霉微觀形態的影響

圖51 -辛烯-3-醇對黃曲霉孢子及菌絲體微觀形態的影響Fig.5 Conidial morphology and hyphal morphology of A.flavus treated by 1-octen-3-ol

如圖5A、B所示，空白組中大部分黃曲霉孢子伸出芽管，孢子形態良好，1-辛烯-3-醇處理組尚無芽管出現并觀察到孢子表面有凹陷現象，且孢子數較少，說明1-辛烯-3-醇對黃曲霉孢子有致畸作用，且會抑制黃曲霉孢子的萌發。

如圖5C～F所示，預培養2 d黃曲霉菌絲體已經形成孢子囊，生長點較為豐富，且其尖端呈現正常的圓錐形，菌絲體粗細較為均勻、飽滿?？瞻捉M（處理4 d）的菌絲體形成的孢子囊極多，且有很多成熟的孢子掉落，菌絲體粗細均勻且較為飽滿。處理組的菌絲呈現不規則扭曲、干癟，表面褶皺不平，生長點數量極少，菌絲體較細。說明1-辛烯-3-醇對黃曲霉菌絲體也有明顯的致畸作用。

2.6 1-辛烯-3-醇對黃曲霉線粒體膜電位的影響

圖61 -辛烯-3-醇對黃曲霉菌絲體羅丹明染色的結果Fig.6 Effect of 1-octen-3-ol on mitochondrial membrane potential of A.flavus

線粒體可為細胞提供能量，與細胞凋亡具有密切關系[33]，羅丹明123是一種可選擇性染色活細胞線粒體的熒光染料，可通過細胞膜在活細胞的線粒體內聚集發出黃綠色熒光。熒光強度越弱說明聚集在線粒體內的染料越少，線粒體膜被破壞越嚴重，ATP合成能力越弱[34]。1-辛烯-3-醇對黃曲霉線粒體膜電位的影響如圖6所示，預培養36 h后，菌絲體呈現出明亮的綠色，說明線粒體膜電位正常；培養48 h及60 h空白組的孢子囊增多且較為為明亮；預培養36 h后暴露于1-辛烯-3-醇12、24 h處理組發生了熒光猝滅現象，熒光強度顯著降低。由此可知，1-辛烯-3-醇可顯著降低黃曲霉線粒體膜電位，減弱黃曲霉線粒體產ATP的能力。

2.7 1-辛烯-3-醇對AFB1生物合成的影響

圖71 -辛烯-3-醇對AFB1的抑制作用Fig.7 Inhibitory effect of 1-octen-3-ol on AFB1 production

AFB1的標準曲線為y=11.028x+9.715 6，R2=0.999 9。由圖7可知，黃曲霉接種2 d后AFB1含量為19.49 μg/kg；培養至第4天AFB1迅速升高，含量高達67.79 μg/kg，而經過預培養2 d后暴露在1-辛烯-3-醇中2 d，AFB1含量為21.68 μg/kg，相較于空白組，AFB1含量下降了68.02%，黃曲霉產生AFB1量得到了很好地控制，抑制其合成速率達到31.98%。

3 結 論

以白黃鏈霉菌TD-1為拮抗菌，以黃曲霉為指示菌，研究培養基中葡萄糖濃度對白黃鏈霉菌TD-1生長和VOCs產量等的影響，在發酵初期，500 mmol/L葡萄糖可抑制白黃鏈霉菌TD-1的生長，但在發酵后期，葡萄糖慢慢被消耗，6 d后阻遏作用被解除，TD-1開始合成次級代謝產物，在發酵后期，有足夠而又不過量的葡萄糖，可對白黃鏈霉菌TD-1的生長以及次級代謝產物的合成起到明顯促進作用，生物量及產生的次級代謝產物VOCs含量較高，產量穩定，其產生的抑菌物質可對黃曲霉菌起到很好的抑制作用。此外，從白黃鏈霉菌TD-1所產生的揮發性物質中篩選出一種食品級揮發物1-辛烯-3-醇，其對黃曲霉生長有較強的抑制作用，可抑制黃曲霉菌的孢子萌發，破壞細胞膜以及線粒體膜完整性，顯著降低黃曲霉菌AFB1的產量。以上研究結果可為微生物源VOCs在食品中的應用提供參考。然而，白黃鏈霉菌TD-1降低AFB1產量是通過抑制黃曲霉生長還是通過1-辛烯-3-醇調控黃曲霉產毒基因還需進一步研究。