急性ST段抬高型心肌梗死患者載脂蛋白E基因多態性與痰瘀證候相關性研究

吳慶和， 楊昌河

（廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣東廣州 510120）

《中國心血管病報告2018》[1]指出，我國心血管病患病人數高達2.9億，其中冠狀動脈粥樣硬化型心臟病（冠心病）患者達1 100萬，而隨著經濟社會的不斷發展，存在冠心病危險因素的人群不斷擴大，患病人數仍將持續上升。冠心病已然成為不可忽視的重大健康問題，這其中，急性ST段抬高型心肌梗死（STEMI）作為冠心病的危重類型，有著較高的致死率和致殘率，如何篩選出可能的危險因素并加以早期干預是重要的研究課題。諸多研究表明，載脂蛋白E（ApoE）基因型多態性被認為是冠心病的獨立危險因素[2]，然而，對于ApoE基因多態性是否與急性心肌梗死相關尚存在爭議[3]，關于STEMI與ApoE基因多態性的關系亦未明確。基于此，本研究旨在探究STEMI患者ApoE基因多態性、血脂水平及其與痰瘀證候的相關性，現將研究結果報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象采用回顧性病例對照研究方法，檢索廣東省中醫院胸痛中心管理系統，篩選2018年1月至2020年10月在廣東省中醫院急診就診或經120救護系統轉運至廣東省中醫院的痰瘀證STEMI患者作為觀察組。所有患者均行急診冠狀動脈造影術，且造影結果提示至少存在1支心外膜冠狀動脈或其主要分支狹窄50%以上（排除冠狀動脈肌橋），并根據患者臨床特點及病變嚴重程度行單純冠脈造影術、冠狀動脈球囊擴張和（或）支架植入術。按照納入及排除標準，經兩名研究者分別復核后，共收集STEMI患者82例，其中男性65例，女性17例，年齡（62.9±12.7）歲。同時，收集同期在廣東省中醫院就診的經體質辨識認定為痰濕質、濕熱質、瘀血質的健康體檢者，經年齡及性別匹配后作為對照組，共112例，其中男性90例，女性22例，年齡（62.0±12.6）歲，此部分受試者均無明顯胸悶痛、心酶和心電圖特征性變化等冠心病臨床表現。

1.2 診斷標準STEMI診斷標準：參照《急性ST段抬高型心肌梗死診斷與治療指南（2019）》[4]中的相關診斷標準。中醫辨證標準：參照《中醫內科病證診斷療效標準》[5]中的相關辨證標準。對照組體質辨識參照《中醫體質分類與判定》[6]。

1.3 納入標準

1.3.1 病例納入標準①于2018年1月至2020年10月在廣東省中醫院急診就診或經120救護系統轉運至廣東省中醫院就診，明確診斷為STEMI；②中醫證型屬于痰瘀證；③病歷資料完整；④年齡≤85歲；⑤與其他研究個體不存在血緣關系；⑥知情并愿意配合ApoE基因型檢測的患者。

1.3.2 對照組納入標準①于2018年1月至2020年10月在廣東省中醫院體檢；②無明顯胸悶痛、心酶和心電圖特征性變化等冠心病臨床表現；③中醫體質類型為痰濕質、濕熱質、瘀血質；④年齡≤85歲；⑤與其他研究個體不存在血緣關系；⑥知情并愿意配合ApoE基因型檢測者。

1.4 排除標準所有研究對象（包括觀察組和對照組），若出現以下任意一項者均予以排除：①不符合納入標準者；②年齡＞85歲者；③與其他個體存在血緣關系者；④不愿意配合ApoE基因型檢測者；⑤患有缺血性腦卒中[7]、嚴重的肝腎功能異常、家族性高脂血癥、惡性腫瘤以及免疫系統疾病的患者。

1.5 儀器和試劑載脂蛋白E（ApoE）基因型檢測試劑盒（基因芯片法）、PCR擴增儀（ABI2720）、基因芯片閱讀儀（Sinochips-PGA）均由珠海賽樂奇生物技術有限公司提供。ApoE基因型檢測由廣東省中醫院中心實驗室分子診斷組完成，其他血液生化指標由廣東省中醫院檢驗科進行檢測。

1.6 研究方法

1.6.1 臨床資料采集及血生化檢測患者病史由首診醫生及時采集并進行體格檢查，包括性別、年齡、現病史、既往史、家族史、吸煙史、飲酒史、身高、體質量等，緊急手術患者為術后補充采集，空腹8 h后于次日清晨進行靜脈血采集，檢測甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、肝腎功能等。

1.6.2 ApoE基因型檢測方法應用基因芯片法，即采用ApoE基因檢測試劑盒（國械注準20173400132）進行ApoE基因型檢測。檢測原理：PCR擴增特定基因片段與芯片上特異性核酸探針雜交檢測特定的基因位點序列，放大基因芯片雜交信號至肉眼判讀的水平，判讀112位和158位基因類型。具體操作步驟參照說明書[8]。

1.6.2.1 樣品處理 經過反復震蕩、離心后洗脫的DNA儲存于-20℃備用。

1.6.2.2 目的片段的PCR擴增 ①取PCR反應液，在室溫（25℃）下融化離心10 s；②取制備樣品加入PCR管中；③將PCR擴增管離心；④PCR擴增：95℃變性10 min；94℃，30 s→56℃，30 s→72℃，30 s，進行40個循環；72℃延伸5 min后于4℃密封保存備用。

1.6.2.3 基因芯片檢測 擴增產物經變性、雜交、顯色、離心、干燥后，應用自動分析報告系統判讀基因型。

1.6.2.4 試驗有效性判定（ApoE基因型檢測芯片陰陽性判定）使用基因芯片閱讀儀檢測，相應位點的信號灰度值與背景灰度值差≥4判定結果為陽性，反之，＜4判定為陰性。ApoE基因型判定結果如圖1。

圖1 ApoE基因型判定Figure 1 ApoE genotype determination

1.7 統計方法應用SPSS25.0統計軟件進行數據的統計分析。計量資料采用Kolmogorov-Smironov檢驗進行正態性檢驗，符合正態分布者用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用方差分析；不符合正態分布者用中位數和四分位間距[M（Q1，Q3）]表示，組間比較采用兩獨立樣本Wilcoxon符號秩和檢驗。計數資料用率或構成比表示，組間比較采用卡方檢驗及單因素Logistics回歸分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組ApoE基因多態性比較表1結果顯示：本研究共檢測到ApoE基因型5種，未發現E2/2基因型，其中觀察組基因型頻率分別為E2/3型15.8%，E2/4型1.2%，E3/3型73.1%，E3/4型8.5%，E4/4型1.2%，而對照組只發現E2/3型、E3/3型、E3/4型3種基因型，頻率分別為17.8%、70.5%、11.6%。觀察組與對照組中，均以基因型E3/3頻率和表現型E3等位基因頻率最高，均大于70%。因E2/4、E4/4基因型頻數較低，未納入統計檢驗。2組間各基因型和表現型比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），提示STEMI與ApoE基因型及表現型并無顯著性相關。

表1 觀察組與對照組ApoE基因型多態性比較Table 1 Comparison of ApoE genotype polymorphism between observation group and control group [例（%）]

2.2 2組血脂水平比較表2結果顯示：雖然基因型之間差異并無統計學意義，但血脂水平與基因多態性的數據并不一致。觀察組TC、LDL-C水平明顯高于對照組，HDL-C水平明顯低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01），提示脂質異常可能是導致STEMI的危險因素之一，這與既往研究[9]結論一致；而2組間TG水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 觀察組與對照組血脂水平比較Table 2 Comparison of serum blood lipid levels between observation group and control group[M（Q1，Q3），mmol·L-1]

2.3 觀察組不同證型患者基因多態性比較表3結果顯示：觀察組STEMI患者以瘀證為主，占63.4%（52/82）。其中，E3/4基因型或E4表現型患者以痰證表現為主，而E3/3基因型和E3表現型患者以瘀證表現為主，E3/4基因型患瘀證的概率是E3/3型的0.17倍[OR=0.17，95%CI=（0.03，0.96）]，E4表現型患瘀證的概率是E3型的0.15倍[OR=0.15，95%CI=（0.03，0.82）]，差異均有統計學意義（P＜0.05）。而E2/3基因型和E2表現型組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表3 觀察組不同證型急性ST段抬高型心肌梗死（STEMI）患者基因多態性比較Table 3 Comparison of gene polymorphisms in patients with different syndromes of acute STEMIin observation group [例（%）]

3 討論

冠心病是在多種因素作用下的冠狀動脈粥樣硬化形成，進而使冠狀動脈狹窄或閉塞或功能性改變，從而導致心肌缺血、缺氧甚至壞死的一類疾病。其中的急性ST段抬高型心肌梗死（STEMI）是其嚴重類型，而絕大多數的STEMI與不穩定的冠狀動脈斑塊破裂有關。對于冠狀動脈粥樣硬化的形成有各種各樣的假說，“脂質浸潤學說”就是其中的一種。已經有大量研究表明，異常的脂質代謝對冠心病的形成、發展及預后危害極大。作為維持和調控血脂代謝平衡有重要作用的載脂蛋白E（ApoE）及其基因多態性自然成為了冠心病的研究熱點之一。ApoE基因位于第19號染色體長臂1區3帶2亞帶（19q13.2）[3]上，共產生E2/2、E2/3、E2/4、E3/3、E3/4、E4/4等6種主要基因型。一般認為，ApoE3為野生型，占比最高，達60%以上[10]，這也與本研究的70%以上占比相符。有研究[11]表明，ApoE基因可影響14%～16%的血中膽固醇水平。隨著研究的不斷深入，ApoE基因多態性也被認為是冠心病的獨立危險因素[12]之一；同時，ApoE4等位基因還被認為與冠脈病變嚴重程度[13]、支架內再狹窄（ISR）[14]、早發冠心病[15]、冠心病痰瘀證候[16]等相關。然而，在心肌梗死方面并未取得一致意見[17-18]。關于STEMI發病與ApoE基因多態性的關系鮮有人提及，其中醫證型與ApoE基因多態性的研究則更少。

中醫理論認為，胸痹的病機是“陽微陰弦”，真心痛作為胸痹重癥，“本虛標實”亦是被學術界所公認的病機。在標實方面，既往研究[19-20]表明，真心痛之證型多以氣滯、痰凝、血瘀為標；而易建新[21]、曾吉祥等[22]在證素方面的研究中發現，血瘀、痰濁為最常見的中醫證素。而縱觀當前對真心痛的治療，大多以活血化瘀為主而少以痰證為主進行治療。

基于此，本研究以符合痰瘀證辨證的STEMI患者作為觀察組，并與健康體檢者的對照組相比較，進一步探討STEMI患者的ApoE基因多態性分布和血脂水平情況，以及痰證和瘀證不同中醫證素與ApoE基因多態性分布的關系。研究結果表明，觀察組與對照組中E3等位基因頻率最高，分別為74.2%、70.5%，與既往研究相符。而2組間各基因型和各表現型比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。然而，值得注意的是，在ApoE基因多態性無顯著性差異的情況下，2組的血脂水平依然呈現出了顯著性差異，其中觀察組的TC、LDL-C水平明顯高于對照組，而HDL-C水平則明顯低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。表明脂質異常可能是痰瘀證STEMI患者發病的危險因素，而并非負責編碼、調節脂質代謝的ApoE基因，這與部分研究[17]認為ApoE基因多態性是急性心肌梗死危險因素的研究結論并不一致。另外，在痰瘀證素研究方面，STEMI患者以瘀證表現為主，占63.4%（52/82），但在具有E4等位基因的患者中，以痰證居多，差異有統計學意義（P＜0.05），提示E4表現型，尤其E3/4基因型可能與STEMI患者痰證相關，而E3/3基因型及E3表現型可能與瘀證相關。

ApoE基因多態性研究是精準醫療的縮影之一，也是中醫“治未病”思想的重要體現。本研究結果表明，STEMI痰瘀證患者發病可能與ApoE基因多態性并不相關，而與脂質代謝異常相關。由此可推斷，當存在ApoE4等位基因時，良好的脂質控制對患者病情的恢復仍是有益的；而在中醫“治未病”方面，化痰可能比化瘀更值得大家關注。但由于本研究納入的病例較少，因此，確切的結論有待進一步深入研究加以證實。