關節康治療骨性關節炎的網絡藥理學機制

彭鑫玉， 張海濤， 葛穎杰， 蔡淼鑫， 辛鵬飛， 王睿，李林鵬， 賴斌， 樊粵光， 龐智暉

（1.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院全國中醫髖關節病重點專科，廣東廣州 510405；3.樊粵光廣東省名中醫傳承工作室，廣東廣州 510405）

骨性關節炎（osteoarthritis）是一種常見的老年退行性關節病，又稱增生性關節炎、退行性關節炎或骨關節病。該病好發于髖、膝、踝等下肢負重關節，病變常常累及關節軟骨、軟骨下骨、滑膜等組織，最終導致患病關節疼痛、畸形和運動功能障礙，大大降低了患者的生活質量[1-2]。骨性關節炎屬于中醫學“骨痹”的范疇。《濟生方》云：“風寒濕三氣雜至，合而為痹，皆因體虛，腠理空虛，受風寒濕氣而痹也。”痹證的形成內因是正氣不足，外因是風、寒、濕邪的侵入，內虛外感而成痹。關節康為廣州中醫藥大學第一附屬醫院的院內制劑，是樊粵光教授以補腎活血法為組方依據，集臨床近20年的經驗研制而成，治療骨性關節炎療效確切[3]。關節康由熟地黃、補骨脂、杜仲、枸杞、丹參、川芎、紅花、木香、牛膝、木瓜等10味中藥組成，具有補腎壯骨、活血化瘀之功效。既往研究表明，關節康通過促進軟骨基質的合成，抑制軟骨基質的分解進程，可達到促進病變關節軟骨修復的目的[4-5]。本研究基于網絡藥理學構建復方-中藥有效成分-靶點基因-骨性關節炎疾病共表達網絡，并對交集基因進行富集分析，進一步探討關節康治療骨性關節炎的作用機制，以期為其臨床應用及后期試驗奠定理論基礎。現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 關節康活性化合物及其作用靶點預測在中藥系統藥理學數據庫（TCMSP）中，分別檢索關節康中熟地黃、杜仲、枸杞、丹參、川芎、紅花、木香、牛膝、木瓜9味中藥。再依據毒藥物動力學參數（ADME），以生物利用度（OB）＞30%、類藥性（DL）＞0.18為限定條件，篩選9味中藥的有效成分及其作用靶點。因在TCMSP中未能檢索出補骨脂，故應用中藥分子機制的生物信息學分析工具（BATMAN-TCM，http://bionet.ncpsb.org/batmantcm）來預測補骨脂的作用靶點，其通過“藥物相似性分數”的原理進行靶點預測，藥物相似性分數指利用解剖-治療-化學的藥物分類系統（ATC）、藥物的副作用，化合物相互作用計分的相似度，蛋白相互作用網絡中心趨向性，功能富集相似度等計算得出各類相似分數，并通過LODO（leave-one-drug-out）法對預測結果進行驗證，確保預測更為精確。即：將關節康中藥的大寫拼音分別輸入至TCMSP或BATMAN-TCM數據庫中，并將預測靶點基因的條件設置為默認值，得出10味中藥的化合物成分及其預測的靶標基因。

1.2 骨性關節炎疾病靶點檢索以“osteoarthritis”為檢索詞，在GeneCards（https://www.genecards.org/）、在線人類孟德爾遺傳（OMIM）（https://omim.org/）2個在線數據庫中檢索骨性關節炎已知相關疾病靶點，將2個數據庫檢索出的疾病靶點匯總去重后得到骨性關節炎疾病靶點。

1.3 關節康-骨性關節炎疾病交集靶點基因相互作用網絡的構建及核心基因篩選獲取關節康相關預測作用靶點和骨性關節炎已知疾病靶點后，用R語言運行腳本取兩者靶點基因重疊交集，將交集基因導入STRING在線數據庫（http://stringdb.org/）進行蛋白相互作用網絡的構建。通過R語言運行腳本分析計算每個靶點基因的鄰接基因數目（即靶點基因之間相互作用的連線數目），并采用Excel作條狀圖以直觀顯示。

1.4 關節康-靶點-骨性關節炎疾病調控網絡構建為了進一步了解關節康治療骨性關節炎的作用機制，將上述3步得到的“關節康-靶點-骨性關節炎”靶點導入Cytoscape 3.7.2軟件（http://www.cytoscape.org）進行關節康治療骨性關節炎疾病可視化調控網絡模型的構建，其結構關系為“關節康-10味中藥-有效化合物-靶點-骨性關節炎”。

1.5 基因本體論（GO）分析GO分析是一個在生物信息學領域中廣泛運用的系統，它包括生物學的3個方面：細胞組分、分子功能、生物過程。DAVID數據庫是一個集生物功能注釋、網絡可視化和集成發現于一身的多功能生物信息數據庫。本研究應用DAVID分析工具（https://david.ncifcrf.gov/）對關節康-骨性關節炎疾病交集靶點基因進行GO富集分析，根據統計學超幾何分布定量（P值）評價存在于各GO注釋中的蛋白質群，以P值反映蛋白質生物學功能的顯著性。將物種與背景設置為“Homo sapiens”（人類），設定P＜0.01，得到關節康治療骨性關節炎的生物過程、分子功能、細胞組分結果。采用ImageGP在線作圖工具（http://www.ehbio.com/ImageGP/）制作GO分析結果氣泡圖。

1.6 京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析算法原理與GO富集分析相同。應用DAVID工具對關節康-骨性關節炎疾病交集靶點基因進行KEGG通路分析（設定P<0.01），將物種與背景設置為“Homo sapiens”（人類），得到關節康治療骨性關節炎的主要作用通路，并對其通路進行分析，采用ImageGP在線作圖工具制作KEGG通路氣泡圖。

2 結果

2.1 關節康有效化合物、作用靶點及骨性關節炎疾病靶點的預測結果通過TCMSP和BATMANTCM平臺檢索總共預測到關節康的有效化合物95個，其中，熟地黃1個，木香3個，木瓜2個，紅花14個，枸杞子9個，杜仲20個，丹參52個，川芎4個，川牛膝3個，補骨脂4個，中藥之間存在17個共同有效化合物。隨后，獲得其作用靶點共257個。通過GeneCards和OMIM數據庫共篩選獲得骨性關節炎疾病靶點共2 868個。取兩者靶點的交集，最終獲得關節康-骨性關節炎疾病交集靶點共109個。見圖1。

圖1 關節康和骨性關節炎疾病的交集靶點基因圖Figure 1 Venny diagram of intersection targets of Guanjie Kang and osteoarthritis

2.2 關節康-骨性關節炎疾病交集靶點基因相互作用可視化網絡及關鍵基因篩選結果利用STRING在線數據庫構建了交集靶點基因蛋白相互作用網絡，見圖2。蛋白相互作用網絡包含38個蛋白質節點，659條相互作用關系，即節點間的連接線。然后從STRING輸出string_interactions.tsv，并將其輸入Cytoscape 3.7.2軟件中，使用“CytoNCA”插件對該蛋白相互作用網絡模型做關鍵靶點篩選，以該網絡中的節點度值（Degree）大于平均值，獲得關鍵靶點基因38個。

圖2 關節康-骨性關節炎交集基因的蛋白相互作用網絡圖Figure 2 Protein-protein interaction network of Guanjie Kang-osteoarthritis intersection targets

2.3 關節康-靶點-骨性關節炎疾病可視化調控網絡采用Cytoscape 3.7.2軟件將關節康-靶點-骨性關節炎疾病繪制可視化調控網絡圖（見圖3），圖中清晰可見關節康中10味中藥與有效化合物、有效化合物與關鍵靶點基因、關鍵靶點基因與骨性關節炎疾病之間分別的對應關系。關鍵靶點基因所連接的有效化合物越多，表明度值越大，該靶點則更重要。網絡中，右邊V字四邊形38個節點為關鍵靶點基因，左邊三角形95個節點為有效化合物。錯綜復雜的“邊”（連線），代表了關節康中10味中藥所含的多種有效化合物通過多條途徑作用于靶點基因。

圖3 關節康-靶點-骨性關節炎疾病可視化調控網絡Figure 3 Visual controlling network of Guanjie Kangtarget-osteoarthritis

2.4 交集基因的GO富集分析結果應用DAVID在線分析工具對關鍵靶點基因進行分析，將P值設定為（P≤0.01）并按照P值升序排列獲得49個功能富集，其中，包括生物過程29個，分子功能10個，細胞組分10個。選取排名前10位的生物過程、分子功能、細胞組分繪成氣泡圖（見圖4），圖中氣泡顏色越深，氣泡越大，則表示功能富集的基因數目越多，該功能富集更為重要。GO富集分析結果顯示，關節康-骨性關節炎疾病交集關鍵基因的生物過程主要是RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、轉錄的正調控和DNA模板、藥物反應、一氧化氮（NO）生物合成過程的正調控、細胞對脂多糖的反應、凋亡過程負調控、血管生成、基因表達的正調控、序列特異性DNA結合轉錄因子活性的正調控、細胞增殖的正調控等；分子功能為轉錄因子結合、蛋白磷酸酶結合、相同的蛋白結合、酶結合、生長因子活性、細胞因子活性、蛋白結合、轉錄調節區DNA結合、轉錄激活活性-RNA聚合酶Ⅱ核心啟動子近端區序列特異性結合、蛋白質異二聚活性等；細胞組分為細胞外空間、細胞外區域、胞質、血小板-阿爾法顆粒管腔、轉錄因子復合物、細胞核、質膜外側面、質膜穴樣內陷、核漿、受體復合體等。

圖4 關節康-骨性關節炎疾病交集基因的GO富集分析結果Figure 4 Go enrichment analysis results of Guanjie Kang-osteoarthritis intersection targets

2.5 關鍵基因的KEGG富集分析結果關節康-骨性關節炎疾病交集的關鍵靶基因的KEGG富集分析結果主要涉及癌癥通路、南美錐蟲病（美洲錐蟲病）、TNF信號通路、缺氧誘導因子1（HIF-1）信號通路、膀胱癌、百日咳、乙型肝炎、利什曼病、沙門氏菌感染、癌癥中的蛋白多糖等信號通路。見圖5。

圖5 關節康-骨性關節炎疾病交集的關鍵靶基因的KEGG富集分析結果Figure 5 KEGG enrichment analysis results of key Guanjie Kang-osteoarthritis intersection targets

3 討論

本研究借助網絡藥理學手段，初步挖掘、分析關節康治療骨性關節炎的可能作用機制，并針對目前相關性較強且文獻研究較充足的通路進行分析討論。通過GO富集分析顯示，關節康主要通過RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、NO生物合成過程的正調控、細胞對脂多糖的反應、血管生成等作用于骨性關節炎疾病。生物過程中RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控的顯著性居于首位。目前研究發現在骨性關節炎患者的關節液和組織中觀察到炎癥反應，并且炎癥機制被認為是促進骨性關節炎進展的危險因素[6]，而RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控與炎癥機制密切相關。脂多糖又稱內毒素，通過激活Toll樣受體4，引發一系列信號級聯反應，進而激活NF-κB，從而啟動一系列免疫相關基因[7-8]，導致炎性細胞浸潤，誘發或加重炎癥反應[9]。故推測關節康可能通過RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控和細胞對脂多糖的反應來控制炎癥進而達到治療骨性關節炎的目的。

骨性關節炎的主要病理改變為關節軟骨的進行性丟失和破壞[10-11]，軟骨損傷時會分泌蛋白來修復受損的細胞外基質，該過程可導致軟骨的內環境平衡改變，促進細胞因子分泌，影響凋亡通路，引起軟骨細胞凋亡發生[12]。受損的軟骨細胞產生一種介導軟骨細胞雙重作用的多功能分子一氧化氮（NO）[13]，NO可以保護培養的軟骨細胞免受氧化應激損傷，但NO升高可以抑制軟骨細胞中白細胞介素1受體拮抗劑（IL-1RA）的合成，而軟骨細胞產生的IL-1RA可有效抑制軟骨的損傷與破壞，故NO升高異常是骨性關節炎發生的危險因素之一[14]。骨性關節炎關節的血管生成與炎性反應相互影響[15]。骨性關節炎伴有滑膜炎癥，且病理特征為巨噬細胞浸潤，該細胞可分泌血管內皮生長因子（VEGF）[16]，VEGF可促進血管生成，有研究發現小鼠關節腔注射VEGF可誘發骨性關節炎[17]。軟骨細胞肥大（軟骨細胞表型發生改變）和軟骨內血管生成存在相互依存關系[18]，骨性關節炎患者軟骨內血管生成可能誘發軟骨內成骨，進而引起關節軟骨細胞外基質礦化[19]。因此，關節康可能通過作用于NO生物合成過程的正調控和血管生產等來調控關節軟骨生產、凋亡、鈣化等而達到治療骨性關節炎的目的，具體機制還需進一步研究。

通過KEGG富集分析，關節康主要通過癌癥通路、南美錐蟲病（美洲錐蟲病）、TNF信號通路、HIF-1信號通路、膀胱癌、百日咳、乙型肝炎、利什曼病、沙門氏菌感染、癌癥中的蛋白多糖等作用于骨性關節炎疾病。其中腫瘤通路的顯著性最高，目前有研究顯示，在骨性關節炎患者滑膜組織中發現了腫瘤信號通路的高調控，說明骨性關節炎滑膜組織具有腫瘤樣特性，因此腫瘤通路可能為骨性關節炎治療和診斷的潛在靶點基因[20]。本研究結果顯示，膀胱癌和癌癥中的蛋白多糖與骨性關節炎密切相關，則是對上述觀點的再次驗證。目前發現，TNF-α在骨性關節炎發生、發展中起重要作用[21]，TNF-α在骨性關節炎患者血漿及關節液中的含量明顯高于正常人，并且TNF-α在關節內的含量與骨性關節炎病變程度密切相關[22]。TNF-α在骨性關節炎中過度表達可導致滑膜增生肥厚，并引起關節軟骨的內環境改變，加重骨性關節炎退化。因此，抑制TNF-α在滑膜中的表達，有利于降低骨性關節炎的發病率，減輕病變程度[23]。因關節軟骨中無血管，這限制了氧從滑液和軟骨下骨到軟骨細胞的擴散[24]。HIF-1由2個不同的亞基HIF-1α和HIF-1β組成，HIF-1α對軟骨細胞的存活具有重要作用[25]，HIF-2α是自噬通量的有效負調節因子[26]，對骨性關節炎起著整體有害作用，HIF-2α介導軟骨破壞以及軟骨細胞死亡，均促進骨性關節炎病程的發展[27]。目前，尚未發現骨性關節炎與南美錐蟲病（美洲錐蟲病）、百日咳、乙型肝炎、利什曼病、沙門氏菌感染等感染性疾病有直接聯系。因此，推測關節康可能通過調控TNF和HIF-1來達到治療骨性關節炎的目的。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學分析關節康治療骨性關節炎的作用機制，發現關節康可能是通過癌癥通路、TNF、HIF-1、NO生物合成過程的正調控、血管生成、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控和細胞對脂多糖的反應等來治療骨性關節炎，但還需要進一步的實驗研究加以驗證。關節康治療骨性關節炎是多靶點、多通路、多選擇的復雜機制過程，是中醫藥防治疾病的整體觀念和辨證論治指導思想的有效印證，為進一步理解關節康治療骨性關節炎的作用機制提供了重要的線索，更為中醫藥治療骨性關節炎提供了新的研究思路。本研究的局限性在于僅對關節康治療骨性關節炎的作用機制進行了預測，具體機制尚待進一步研究證實。