基于穩定同位素比值的陽春砂產地判別分析

鐘慧怡， 黃海波， 陳玉娥， 覃挺紅

（廣州中醫藥大學中藥學院，廣東廣州 510006）

陽春砂為姜科植物Amomum villosumLour.的干燥成熟果實，味辛、性溫，歸脾、胃、腎經，具有化濕開胃、溫脾止瀉、理氣安胎等功效，臨床上多用于濕濁中阻、脘痞不饑、脾胃虛寒等證[1]，是治療胃腸疾病的常用藥，為“香砂六君丸”“香砂理中丸”等著名中成藥的組方原料[2]。陽春砂主要產于廣東省陽春市，近年來產區逐漸由陽春及其周邊變遷到廣西南寧、百色、崇左及云南西雙版納、紅河等地。由于引種產地具有適宜的環境氣候和較為成熟的種植技術，陽春砂得到了大規模的種植。但不同產地的陽春砂在化學成分和藥理作用上有所差別（道地產地的質量較優），且其市場價格差距較大，以次充好的現象時常發生，造成了陽春砂商品來源復雜混亂的現狀[3]，因此，為保護藥材道地性、提升消費者信心，有必要對陽春砂進行產地溯源。目前，常用的溯源技術主要有高效液相色譜法、氣相色譜法以及穩定同位素比質譜法等，其中，穩定同位素比質譜法是近年來逐步發展的一種新型溯源技術，廣泛應用于各行各業如中藥材[4-7]、稻米[8]、茶葉[9]、果蔬類[10-11]等的產地溯源，具有無污染、高精密度、高準確度等優點。既往有研究發現：不同產地何首烏的穩定同位素比值具有明顯的地域分布特征，結合化學計量學方法可有效對何首烏進行產地溯源[5]；利用碳、氮穩定同位素對青海、云南、四川以及尼泊爾等12個產地的冬蟲夏草樣品進行產地區分，結果發現不同地區的樣品之間δ15N差異較大，可以利用δ15N比值對大多數樣品的產地來源進行有效的區分[7]；不同產地的茶葉中穩定同位素δ15N、δ13C、δD和δ18O的數值范圍也不同，表現出一定的地域特征[9]。本研究采用穩定同位素比質譜法檢測，結合正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）與線性判別分析方法（LDA）建立陽春砂產地判別模型，初步對廣東、廣西及云南產的陽春砂進行產地溯源和判別，探討用于陽春砂產地溯源和地理標志產品保護的可行性，以期為陽春砂的道地性保護提供借鑒和技術支持。現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料陽春砂樣品主要采集于廣東、廣西和云南3省，購于當地藥農，由廣州中醫藥大學中藥學院黃海波副教授鑒定為姜科植物陽春砂（AmomumvillosumLour.），總樣品量為39個。收集的干果用密封袋封裝，置于4℃冰箱冷藏保存。樣品產地信息見表1、圖1。

圖1 陽春砂樣品采集地點Figure 1 The locations of collecting Amomum villosum samples

表1 陽春砂樣品產地信息表Table 1 The information of Amomum villosum habitats

1.2 陽春砂樣品的測定

1.2.1 碳、氮穩定同位素比值的測定稱取5 g制備好的樣品包入錫囊，排盡空氣，放入元素分析儀的固體進樣器依次進樣。樣品在高溫的過氧環境下瞬間燃燒，燃燒產生的氣體被氦載氣流帶入并通過氧化還原反應管，氣體在高純氦氣的運載下經還原轉化成CO2（N2），隨后氣體通過色譜柱將CO2和N2氣體分開后進入質譜儀的離子源進行電離，形成的離子束經磁分析器將不同質荷比的離子完全分離，最后進入到檢測器進行分析和測定。測定結果用單點校正法計算。

元素分析儀測定：氧化爐溫度1 020℃，還原爐溫度680℃，載氣流速90～100 mL·min-1，注氧時間3 s，吹掃流量180 mL·min-1。

1.2.2 氫穩定同位素比值的測定稱取適量的樣品于錫杯中并將其放置于90℃的烘箱內干燥12 h，以去除樣品表面的吸附。再將烘烤后的樣品置于高溫裂解爐中進行裂解反應，礦物包體水、含羥基的單礦物或有機物在裂解釋放后與玻璃碳瞬間反應生成H2，被高純氦氣攜載經過色譜柱進入同位素質譜儀，測定H2的同位素比值δD。測定結果用單點校正法計算。

元素分析儀測定：爐溫1 380℃，載氣流速150 mL·min-1，吹掃流量200 mL·min-1。色譜柱溫50℃。

2 測定結果與數據分析

2.1 計算方法與數據處理重同位素豐度與輕同位素豐度之比用同位素比值R表示，樣品R值與國家標準物R值的比較用δ來表示，即δ13C、δ15N、δD，用該值代表樣品的同位素比值，計算公式：δ（‰）=（R樣品/R標準-1）×1 000。

應用SPSS23.0統計軟件對不同產地的陽春砂樣品3種穩定同位素比值進行差異分析及線性判別分析。利用SIMCA-P Version 14.1軟件（瑞典Umetrics AB公司）進行正交偏最小二乘法判別分析。

2.2 陽春砂C、N、H穩定同位素比值差異分析陽春砂樣品中δ13C、δ15N及δD的含量測定結果見表2，利用K-W檢驗不同組間的同位素比值是否有差異。從表3得知，不同省份之間的δ13C和δD有顯著性差異（P＜0.01），表明3個省份陽春砂的同位素比值有差異，能夠為后續產地判別的可行性提供依據。所測得的39份陽春砂中的δ13C值在-31.41‰～-25.44‰之間，根據均值大小排列依次是云南＞廣東＞廣西；3個省份的δ15N值在-2.61‰～2.93‰之間，按大小排列依次是云南＞廣西＞廣東。其比值相差不大，說明不同省份陽春砂的生長環境及施肥方式等因素不足以造成氮同位素比值的顯著性差異。降水影響著氫同位素的組成，距海越近，雨水及地下水中D含量越大。所測得的樣品δD值在-68.76‰～-45.64‰之間，不同省份之間δD值差異較大，按大小排列依次是廣東＞廣西＞云南。

表2 陽春砂樣品C、N、H穩定同位素測定結果Table 2 Determination results of C，N，H stable isotopes of Amomum villosum

表3 K-W檢驗統計Table 3 Statistical results of K-W test

進一步選取樣品數較多、具有地域代表性的產地進行分組，分別是廣東陽春、廣西崇左、云南西雙版納、云南文山這4個產地樣品的δ13C、δ15N、δD比值進行差異分析。4個代表產區的陽春砂δ13C值介于-31.35‰～-25.94‰之間，崇左相對貧化，文山相對富集。δ15N值介于-1.02‰～2.93‰之間，崇左相對貧化，西雙版納相對富集。δD值則介于-68.76‰～-45.64‰之間，西雙版納相對貧化，陽春相對富集。具體結果見表4~5。

表4 3個省份陽春砂樣品C、N、H穩定同位素描述統計表Table 4 Description of statistics of C，N，H stable isotopes of Amomum villosum from 3 provinces

2.3 正交偏最小二乘法判別分析觀察表2~5數據，可以發現3個省份的陽春砂樣品中δ13C、δ15N、δD的含量比值存在一定的差異。為了使分析結果更加直觀可靠，且具有統計學意義，采用有監督性分析OPLS-DA，可減少組內差異，篩選造成分類的差異變量。為了幫助選擇貢獻較大的差異組分，變量權重重要性排序（variable importancein projection，VIP）值被作為多維模型差異元素選擇的指標[12]。VIP值越大，該成分在不同省份的陽春砂樣品中的差異越顯著。按照經驗值，VIP值大于1的組分即為多維模型的貢獻變量，其中，VIP值大于1.5的組分可被標記為非常顯著的貢獻變量。

將樣品按省份分為廣東、廣西和云南3組，利用δ13C、δ15N、δD這3個同位素比值進行正交偏最小二乘法判別分析，OPLS-DA得分見圖2。廣東與云南的樣品得到較好的分離，但廣西有部分樣品與廣東、云南均有重疊，不能較好地分離。3個省份樣品的同位素VIP值見表6，VIP值大于1的組分共2種，δD、δ13C為貢獻變量，其中δD標記為非常顯著的貢獻變量，說明這2個同位素在樣品分類中起著關鍵作用。

圖2 廣東、廣西、云南陽春砂樣品的同位素OPLS-DA得分圖Figure 2 OPLS-DA scores of Amomum villosum from Guangdong，Guangxi and Yunnan

表5 4個代表產區的陽春砂樣品C、N、H穩定同位素描述統計表Table 5 Description of statistics of C，N，H stable isotopes of Amomum villosum from 4 representative habitats

再選取廣東陽春、廣西崇左、云南西雙版納、云南文山這4個產地樣品的δ13C、δ15N、δD比值進行OPLS-DA分析，得分見圖3。由圖可知：文山的樣品得到較好的分離，樣品間的距離小；陽春的樣品也基本得到分離，但各樣品間的距離較大；而崇左和西雙版納的分離效果較差，崇左的部分樣品落在陽春和西雙版納的范圍內，西雙版納的樣品分布位置較散，有部分樣品與文山歸為一類。4個產地樣品的同位素VIP值見表6，貢獻變量同樣為δD、δ13C，且均被標記為極顯著的貢獻變量。

表6 陽春砂樣品的同位素VIP值Table 6 The VIP values of Amomum villosum samples

圖3 陽春、崇左、西雙版納、文山陽春砂樣品的同位素OPLS-DA得分圖Figure 3 OPLS-DA scores of Amomum villosum from Yangchun，Chongzuo，Xishuangbanna and Wenshan

2.4 基于線性判別分析方法的陽春砂產地區分模型通過OPLS-DA篩選出具有顯著差異性的同位素δ13C、δD，利用這2個同位素比值進行線性判別分析，判別結果顯示產地回判的正確率有76.9%，分類結果見表7。有30.0%的廣東樣品被錯誤地歸類到廣西，16.6%的廣西樣品也被誤歸到廣東。由于云南的地理位置與廣東差距較大，兩省份的樣品無相互錯判的情況，分類效果較好。但云南與廣西位置相鄰，有11.8%的云南樣品被錯誤歸類到廣西，16.7%的廣西樣品也被錯誤歸類到云南。再針對廣東陽春、廣西崇左、云南西雙版納、云南文山這4個產地進行判別，回判正確率89.7%，說明此模型比較適于陽春砂產地溯源。分類結果見表8。

表7 廣東、廣西、云南3個省份陽春砂樣品穩定同位素判別結果Table 7 Discrimination results of the stable isotopes of Amomum villosum from Guangdong，Guangxi and Yunnan

表8 陽春、崇左、西雙版納、文山4個產地陽春砂樣品穩定同位素判別結果Table 8 Discrimination results of stable isotopes of Amomum villosum from Yangchun，Chongzuo，Xishuangbanna and Wenshan

3 討論

由于不同地域的氣候、降水、地質、土壤以及人為等因素的不同，導致生長在地理位置差距大的同種植物的同位素豐度出現一定的差異。植物體內對氮素的固化、同化、吸收和排除過程影響著氮同位素的分餾作用。因此，植物的生長環境和施肥方式等都可能導致氮同位素比值的變化，尤其是施肥方式對氮素的影響較為顯著[13-15]。但不同產地陽春砂δ15N的變化范圍較小，其比值相差不大，地域特征不明顯。說明不同省份陽春砂的生長環境及施肥方式等因素不足以造成氮同位素比值的顯著性差異。而δD、δ13C的變化范圍較大，有一定的差異性和地域特征（P＜0.01）。植物體內C同位素的組成主要與其固定CO2的方式，即光合作用途徑（C3、C4、CAM）有關，同一物種固定CO2的方式相同且13C在固定范圍內，但氣溫、降水及大氣中CO2濃度等影響因素可能會造成δ13C比值的差異，通常與13C呈負相關關系[15]。觀察表4、5數據，根據δ13C均值大小排列依次是云南＞廣東＞廣西，其中，廣西崇左相對貧化，云南文山相對富集，可能與云南陽春砂生長環境中的氣溫、降水量低于其他2個省份的原因有關。云南各產地的氣溫在16.3～20.5℃之間，廣東與廣西的氣溫較接近，均在21.2～22.6℃范圍內。云南的年平均降水量為779.0～2 026.5 mm，廣西為1 000.0～1304.2 mm，而廣東的降水量相對較高，在1 650.0～2 116.0 mm之間。降水也影響著氫同位素的組成，通常為正相關關系，距海越近，雨水及地下水中D含量越大。廣東南臨南海，廣西南臨北部灣，故廣東的δD遠高于云南，其中陽春相對富集，西雙版納相對貧化；而廣西介于二者之間，δD值介于-68.76‰～-45.64‰之間。

在建立判別模型時，自變量的個數多并不代表結果更好，若未加選擇地使用全變量進行分析，可能會產生較大的偏差。因此，本研究采用OPLS-DA對不同產地的陽春砂樣品進行初步判別，篩選出具有顯著差異性的同位素，再利用經篩選后的差異性指標建立LDA判別模型，減少出現判別結果的偏差，提高判別效果及可信度。利用δ13C、δD的比值建立廣東、廣西、云南等3個省份的產地判別模型，判別率僅為76.9%，產地判別的正確率不高。可能因為這3個省份的自然氣候和生態環境相似，不足以導致同位素比率的顯著性變化，所以，有部分樣品被誤判到鄰近的省份。進一步選取廣東陽春、廣西崇左、云南西雙版納、云南文山這4個樣品數較多且具有地域代表性的產地樣品進行判別分析，所得判別率達到89.7%，說明這4個產地的判別模型良好，具有一定的可行性，但后續仍需要結合更多其他指標作進一步判別分析，提高模型的準確性。

利用穩定同位素比值建立的判別模型，正確率不高的可能性有：分析的指標少，獲得的同位素信息面不全；所采集的樣品其地理位置差距不大，導致同位素比值的差異不足以準確地區分不同產地的陽春砂；樣本量有限，無法反映整體的差異性。因此，需要結合更多的分析指標如無機元素、有機成分等指標，以及增加地理位置差距大的樣品數量來提高判別正確率，才可為陽春砂的產地鑒別提供更多的科學依據，以進一步證明該方法的可行性。

綜上所述，穩定同位素比質譜法作為一種新型的檢測技術，結合多元統計方法可為中藥材的產地鑒別提供一種新的思路。結合OPLS-DA及LDA方法建立不同產地陽春砂的判別模型，分析結果表明廣東陽春、廣西崇左、云南西雙版納、云南文山這4個產地的判別模型良好，具有地域性特征的δ13C、δD有望被應用于陽春砂產地溯源。