蕓豆酵素發酵過程中組分及抗氧化功能研究

王 迪，王 穎,2,3,4, ，張艷莉，佐兆杭，劉淑婷，張 裕，李志芳

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶 163319；2.國家雜糧工程技術研究中心，黑龍江大慶 163319；3.糧食副產物加工與利用教育部工程研究中心，黑龍江大慶 163319；4.黑龍江省農產品加工與質量安全重點實驗室，黑龍江大慶 163319）

現如今越來越多消費者追求營養的多樣性、易于吸收性和平衡性，酵素發酵飲料作為新型功能性食品逐漸被大眾喜愛。食用酵素是以一種或多種新鮮果蔬、豆谷類、藥食兩用食材等為原料，經多種益生菌發酵制得的富含酶、益生菌、礦物質和次生代謝產物等營養成分的功能性微生物發酵產品[1?2]，具有解酒護肝[3?4]、美白抗氧化[5?7]、降糖降脂[8?10]等功效。

蕓豆（Phaseolus vulgarisLinn）學名菜豆，屬蝶形花科的小宗雜糧作物[11]，是栽培面積僅次于黃豆的豆類農作物[12]。蕓豆富含蛋白質、維生素、皂苷等營養成分，蕓豆膳食纖維[13]、山奈酚[14?15]、槲皮素[16]可持續性調控機體糖代謝紊亂，改善胰腺組織內質網應激及線粒體功能，維持血糖水平穩態。蕓豆抗性淀粉[17]、α-淀粉酶抑制劑[18]可以降低高脂血癥大鼠血脂代謝水平，改善氧化應激并調控腸道微生物平衡。黃酮類化合物對心血管疾病[19?20]、癌癥[21?22]等老年疾病有積極的預防、緩解和治療作用。蕓豆提取物還具有補腎利氣、抗炎抑菌[23?24]、利水消腫等多種功效，是開發功能性食品的優質原料。

基于蕓豆主要以鮮食為主，存在加工形式及企業較少、綜合利用程度差等問題，同時目前鮮見復合益生菌發酵蕓豆酵素的研究，其代謝產物及抗氧化能力亦沒有報道。監測發酵體系代謝產物及抗氧化活性，是反映蕓豆酵素發酵進程、產品品質和營養價值的重要依據。因此，本文以蕓豆酵素為研究對象，研究不同發酵時間代謝產物變化規律，分析其抗氧化能力，為蕓豆高值利用及精深加工產業鏈提供新思路，同時為綜合開發兼具蕓豆和益生菌營養保健價值的蕓豆酵素產品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫花蕓豆 黑龍江省黑河市；白砂糖 市售；安琪牌活性干酵母 湖北安琪酵母股份有限公司；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum） 東北農業大學菌庫；嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus） 中國工業微生物菌種保藏中心；耐高溫α-淀粉酶（20000 U/mL）、糖化酶（10000 U/mL） 上海源葉生物科技有限公司；2,4,6-三吡啶基三嗪（TPTZ） 北京中生瑞泰科技有限公司；2,2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS） 美國Sigma公司；葡萄糖、氯化鐵、氫氧化鈉、福林酚（10%）、碳酸鈉、3,5-二硝基水楊酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、無水乙醇 國產分析純試劑。

BS224S電子天平 賽多利斯科學儀器有限公司；JYL-Y912料理機 九陽股份有限公司；S220 pH計 瑞典波通儀器公司；DGG-9023A電熱鼓風干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司；V-5100B可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；HH-1S數顯電熱恒溫水浴鍋 上海達洛科學儀器有限公司；DRP-9082電熱恒溫培養箱 上海培因實驗儀器有限公司；YXQ-30SII立式壓力蒸汽滅菌器 濟南捷島分析儀器有限公司；H1850R冷凍離心機 湖南湘儀儀器有限公司；BCV-6S1超凈工作臺 浙江賽德儀器設備有限公司；ATC-32手持式折光儀 上海淋譽貿易有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 菌種的活化與培養 取甘油保存的菌液100 μL于MRS液體培養基中，37 ℃恒溫培養24 h，無菌操作臺中劃線接入MRS固體培養基中培養（37 ℃，24 h），連續接種3代，使其充分活化。挑取斜面培養基生長較好菌落接種至液體培養基中培養（37 ℃，24 h），搖勻后移取10%（v/v）菌液至液體培養基（37 ℃，24 h），得到擴大培養的乳酸菌菌懸液，待用。活性干酵母于10倍體積蒸餾水中溶解，30~35 ℃恒溫水浴鍋中活化30 min，待用。

1.2.3 蕓豆酵素的制備 紫花蕓豆清洗后去皮，按1:3（g/mL）料水比打漿。雙酶法進行水解，液化條件：α-淀粉酶添加量200 μL/100 mL、pH6.0、酶解溫度97 ℃、時間20 min；糖化條件：加酶量200 μL/100 mL、pH4.5、溫度60 ℃、時間30 min。酶解液于高速離心機中以1.0×104r/min離心15 min，得到蕓豆清汁。調清汁pH4.0，添加6%白砂糖后滅菌。接種0.2%酵母菌于32 ℃恒溫振蕩預發酵24 h，再接種3%復配乳酸菌（植物乳桿菌:嗜酸乳桿菌=1:1）32 ℃恒溫發酵24 h。4 ℃后發酵并保藏。分別在發酵0、8、16、24、32、40、48、56 h時取樣，離心后取上清液，待測。

1.2.4 pH和總酸含量的測定 采用精密pH計測定不同發酵時間的蕓豆酵素的pH。參考GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定方法》測定各樣品總酸含量。

1.2.5 還原糖含量的測定 采用3,5-二硝基水楊酸法進行測定[25]。取0.05、0.01、0.15、0.20、0.25、0.30 mL葡萄糖標準溶液（1 mg/mL）于10 mL試管中，去離子水補至1 mL，加入3 mL DNS試劑，混勻后在沸水浴中加熱5 min，冷卻后定容至10 mL，室溫放置30 min，去離子水作為空白對照，520 nm下測定吸光度，繪制標準曲線。取稀釋待測液，按照標準曲線步驟測定吸光度，根據標準曲線線性方程y=0.1218x?0.1523，R2=0.9952計算發酵液中還原糖含量（以葡萄糖計）。

1.2.6 可溶性固形物的測定 使用折光儀測定各樣品可溶性固形物含量。打開進光板，用柔軟絨布將折光棱鏡擦拭干凈。將蒸餾水數滴，滴在折光棱鏡上，輕輕合上進光板，使溶液均勻分布于棱鏡表面，并將儀器進光板對準光源或明亮處，調整明暗分界線置于零位。擦凈蒸餾水，取一滴蕓豆酵素溶液代替蒸餾水滴于折光棱鏡上，記錄視場相應刻度值。

1.2.7 總酚含量的測定 采用Folin-Ciocalteus法測定[26]，200 μL樣品溶液與0.5 mL福林酚混勻，加入2.3 mL去離子水，放置1 min后加入7.5%（g/mL）碳酸鈉溶液2 mL，混勻，室溫下暗反應2 h。測定760 nm波長下的吸光度值，去離子水代替樣品作為空白對照。沒食子酸（0~250 μg/mL）標準溶液的線性回歸方程為y=0.0045x?0.0022（R2=0.9905）。

1.2.8 黃酮含量的測定 采用NaNO2-Al（NO3）3比色法測定[27]。取500 μL待測發酵液，加入5% NaNO2溶液150 μL，搖勻靜置6 min。加入10% Al（NO）3溶液150 μL，搖勻靜置6 min。再加入4% NaOH溶液2 mL，95%乙醇定容，搖勻靜置15 min，510 nm處測吸光值。

1.2.9 抗氧化活性的測定

1.2.9.1 還原力的測定 參照武悅等[28]的方法制備FRAP試劑。1 mL發酵原液與5 mL FRAP試劑混合，37 °C水浴中反應10 min，以去離子水為空白對照，于593 nm處測定吸光度值。FeSO4（0~50 μmol/L）標準溶液的線性回歸方程為y=0.0307x?0.0132（R2=0.9975）。

1.2.9.2 ABTS+自由基清除能力的測定 參照白海娜等[29]的方法制備ABTS溶液，1.5 mL酵素原液中加入1.5 mL ABTS溶液，蒸餾水代替ABTS溶液作為對照管，蒸餾水代替酵素原液作為空白管，室溫避光放置6 min，734 nm測定其吸光度，計算公式如下：

式中：A1：1.5 mL ABTS溶液與1.5 mL蒸餾水的吸光度值；A2：1.5 mL ABTS溶液與1.5 mL酵素原液的吸光度值；A3：1.5 mL酵素原液與1.5 mL蒸餾水的吸光度值。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 pH和總酸含量的變化

pH是衡量發酵過程是否正常的重要條件，酸度是衡量酵素成熟度及發酵液品質的主要指標之一[30]。由圖1可知，發酵液pH隨著發酵時間的延長而不斷降低，總酸含量則逐漸升高。經48 h發酵，蕓豆酵素pH由4.01降低至3.44，總酸含量從發酵初期0.03 g/100 mL至后期增漲至0.57 g/100 mL。發酵前期總酸含量增幅明顯，分析原因該階段酵母菌大量增殖，在厭氧條件下利用發酵液中的糖原產生CO2及乙醇，部分CO2溶于發酵液，同乳酸作用，降低發酵液pH的同時增加總酸含量。接種乳酸菌后其分泌酶水解發酵液中碳源為單糖后進一步利用產生大量乳酸、蘋果酸等有機酸，導致發酵液pH持續降低，總酸含量穩定增長。蕓豆酵素發酵56 h時，發酵液營養物質基本被完全消耗，乳酸菌利用有機酸作為代替碳源來維持自身增殖代謝等生物過程，使得總酸含量小幅度升高。發酵體系含多種有機酸，可抑制部分有害菌的生長，同時形成了蕓豆酵素的獨特風味[31]。

圖 1 蕓豆酵素發酵過程中pH、總酸含量變化Fig.1 Changes of pH and total acid content in the fermentation process of kidney bean Jiaosu

2.2 還原糖含量與可溶性固形物含量的變化

糖作為碳源是微生物發酵的重要營養物質，其含量的變化是反應酵素液中微生物活動情況的指標之一[32]。由圖2所示，還原糖含量僅在前8 h呈現上升趨勢，而后隨著發酵時間的延長而不斷降低。這可能是由于發酵初期優勢菌種酵母菌在蔗糖酶的作用下將蔗糖轉化為果糖和葡萄糖，使發酵液中還原糖含量增加。發酵8~24 h時，還原糖含量下降較快，該階段酵母菌已適應此時發酵環境，大量的葡萄糖和果糖被利用生成乙醇用于代謝生長。發酵液中果糖等游離糖利于乳酸菌等厭氧微生物增殖生長，接種乳酸菌其自身分泌β-半乳糖苷酶等水解酶分解乳糖成葡萄糖和半乳糖，并通過糖酵解等代謝途徑將葡萄糖轉化成乳酸，還原糖逐漸減少。發酵48 h時，還原糖含量為3.55 mg/mL并趨于平緩，證明發酵已基本結束。

圖 2 蕓豆酵素發酵過程中還原糖、可溶性固形物含量變化Fig.2 Changes of reducing sugar and soluble solids content in the fermentation process of kidney bean Jiaosu

可溶性固形物含量可較為直觀反映發酵液品質，若含量過高，發酵體系滲透壓升高易破壞發酵菌種細胞壁及細胞膜特性，導致生長周期停滯或凋亡；含量過低，發酵液口感酸，影響產品風味[33]。由圖2可知，蕓豆酵素可溶性固形物含量隨發酵時間的延長持續下降并趨于穩定，經48 h的發酵，發酵液中可溶性固形物含量由17.07%降低至6.13%，發酵體系環境適宜，營養物質充足，微生物在該階段迅速繁殖，大量且持續利用碳水化合物，使得蕓豆酵素可溶性固形物含量逐漸降低。

2.3 總酚與黃酮含量的變化

蕓豆酵素發酵過程中總酚含量的變化見圖3?？偡雍吭诎l酵階段呈先迅速上升后小幅度下降而后繼續增長的趨勢。楊小幸等[30]研究表明發酵體系中酚類物質含量的變化與發酵原料、發酵工藝條件及微生物種類密切相關。與未發酵清汁相比，發酵24 h的蕓豆酵素總酚含量顯著增長約1.4倍，分析原因是原料中酚類物質溶出，其一發酵前期發酵液營養物質充足，微生物大量繁殖代謝產生次生代謝產物，這些有機酸及酶類可溶出蕓豆中的酚類物質；其二高糖濃度形成高滲透壓體系，導致原料大量酚類物質的溶出并呈游離態[34]。發酵32 h時，總酚含量略微降低，可能是由于多酚類物質具有抑菌效果，一定濃度的酚類物質會抑制微生物的生長[35]，因此發酵液中優勢菌種會產生降解酚類的物質來維持自身正常繁殖代謝。此外，蛋白質可以與多酚類物質的多元氫鍵和疏水鍵發生反應，也是可能造成多酚含量下降的因素之一[36]。隨著發酵時間的延長，部分微生物逐漸適應發酵環境中的高濃度酚，將一些大分子酚類物質降解為單體酚或小分子量酚類物質[34]，發酵56 h時，發酵液總酚含量進一步增長至367.90 mg/mL。

圖 3 蕓豆酵素發酵過程中總酚、黃酮含量變化Fig.3 Changes of total phenol content and flavonoid content during fermentation of kidney bean Jiaosu

由圖3可知，蕓豆酵素發酵過程中總黃酮含量呈現持續升高的趨勢，由初期30.02 mg/mL迅速上升至56 h的92.31 mg/mL，增漲約3倍且具有顯著性差異（P<0.05）。發酵前期優勢菌種酵母菌生長代謝旺盛產生乙醇，溶解了大部分不溶或難溶于水的黃酮類物質，造成發酵液黃酮含量的迅速增加。整個發酵過程中，發酵體系中黃酮類物質始終以不同速率累積，一方面，發酵液的高滲環境及微生物的活動致使植物細胞破裂，原料中抗氧化物質滲出與合成，同時酵母菌及乳酸菌代謝產生酶系將部分碳源轉化為可以發生顯色反應的鄰苯二酚結構[37]。另一方面，發酵后期糖苷與游離態黃酮類物質結合的黃酮醇配糖體被水解，造成發酵液黃酮類物質含量的進一步升高[38]。

2.4 還原力的變化

由圖4可知，接種酵母菌和乳酸菌后，發酵液還原力均顯著高于未發酵清汁，且還原力隨發酵時間的延長呈現不斷上升的變化趨勢。分析原因，酵母菌和乳酸菌均可通過產生NADH氧化酶、SOD、GSHPx等過氧化酶類物質清除活性氧[39]。酵母菌單獨發酵時，還原力最高可達0.72 μmol/L，可能是由于酵母菌自身含有的細胞壁多糖能夠清除如超氧陰離子自由基等活性氧。發酵56 h時，蕓豆酵素還原力為0.88 μmol/L，乳酸菌自身具備的抗氧化能力主要是代謝產物及菌體表面的抗氧化物質發揮作用。范昊安等[40]研究表明相較于發酵初期，蘋果梨酵素的還原力顯著升高。適當的延長發酵時間有利于蕓豆酵素還原力的增強。

圖 4 蕓豆酵素發酵過程中還原力變化Fig.4 Reduction force changes during fermentation of kidney bean Jiaosu

表 1 蕓豆酵素發酵過程中各參數相關性Table 1 Correlation of various parameters in the fermentation process of kidney bean Jiaosu

2.5 ABTS+自由基清除率的變化

ABTS是一種穩定存在的自由基，可與抗氧化成分發生反應而使體系褪色，清除自由基能力由樣品對其吸光度的影響所反映[41]。蕓豆酵素發酵過程中ABTS+自由基清除率的變化如圖5所示，發酵過程中ABTS+自由基清除率呈現先快速上升后趨于平緩的趨勢。發酵前32 h，ABTS+自由基清除率從30.01%迅速上升至82.49%，隨后以小幅度趨勢上升至發酵后期趨于平緩，整個發酵過程蕓豆酵素ABTS+自由基清除率增漲約3倍。研究表明[30]，ABTS自由基清除能力與高濃度酚類、有機酸等物質的芳香環數量、分子數量和羥基取代基的性質密切相關。Floegel等[42]發現酚類化合物與ABTS+自由基清除率存在密切關系，分析其可能是造成蕓豆酵素具有高ABTS+自由基清楚能力的主要因素。

圖 5 蕓豆酵素發酵過程中ABTS+自由基清除率變化Fig.5 ABTS+ radical scavenging rate during kidney bean fermentation

2.6 相關性分析

蕓豆酵素復合發酵過程中還原糖、總酚、黃酮等功能成分與還原力、ABTS+自由基清除率相關性分析結果如表1所示。還原力與ABTS+自由基清除率呈現極顯著正相關性（P<0.01），與周偏等[36]對諾麗酵素的研究結果一致。蕓豆酵素黃酮與還原力呈極顯著正相關（r=0.99，P<0.01），與ABTS+自由基清除率呈極顯著正相關（r=0.98，P<0.01）；總酚與還原力、ABTS+自由基清除率均呈極顯著正相關（r=0.96，P<0.01），表明黃酮類物質和多酚類物質是蕓豆酵素發酵過程中重要的抗氧化物質。

3 結論

探究蕓豆酵素發酵過程中代謝產物含量以及抗氧化活性的動態變化規律，結果表明，pH呈現持續下降的趨勢，總酸變化趨勢與之相反。發酵初期還原糖含量小幅度上升后不斷降低至3.56 mg/mL。發酵56 h時可溶性固形物含量達到最低6.01%?？偡雍靠傮w呈現上升趨勢，僅在發酵32 h時略微降低。與未發酵蕓豆清汁相比，發酵48 h的蕓豆酵素黃酮含量顯著提高3倍（P<0.05）。還原力和ABTS+自由基清除率呈現迅速升高后趨于平緩的趨勢，發酵大幅度提升蕓豆酵素的抗氧化能力，抗氧化活性的提高與總酚和黃酮含量的變化顯著正相關（P<0.05）。代謝產物含量的變化規律可以較為直觀反映發酵體系周期進程以及發酵液生物活性物質積累情況。蕓豆酵素代謝產物和抗氧化性的研究可為酵素產品的開發及推廣利用提供一定的理論依據及數據支持。