乳酸調控玉米醇溶蛋白基面團流變特性和微觀結構的研究

劉 昊，顧豐穎，朱金錦，楊婷婷，邵之曉，張巧真，王 鋒

（中國農業科學院農產品加工研究所農業農村部農產品加工綜合性重點實驗室，北京 100193）

無麩質食品主要面向約占世界總人口1%的乳糜瀉易感人群[1]，以應對因攝入麩質而引起的腸道不適。無麩質谷物食品市場廣闊，售價偏高[2]，但產品的加工性能一般，品質較差，品類受限。在谷物研究領域，備受關注。玉米醇溶蛋白作為玉米淀粉工業的副產物之一[3]，來源廣泛，儲量巨大。玉米醇溶蛋白在適當的pH環境下，能夠形成蛋白質網絡[4]，具備近似面筋蛋白的功能，是開發無麩質谷物食品的理想原料。有研究表明，添加有機酸可以增強玉米醇溶蛋白的相互作用，促進玉米醇溶蛋白纖維態化，利于蛋白質網絡的構建[5]，提高玉米醇溶蛋白的功能特性，使體系在宏觀上表現出良好的黏彈性、拉伸性[4]。目前，相關研究大多停留于有機酸對玉米醇溶蛋白單質的理化性質調控，僅有Sly等[4]研究了40 ℃以上時，添加少量乳酸/乙酸對玉米醇溶蛋白基面團流變特性及蛋白質構象的影響。但常溫條件下（約25 ℃），有機酸調控玉米醇溶蛋白基面團加工性能的相關研究有待補充。相比醒發酸面團來制備谷物食品，添加有機酸對面團進行直接酸化，無需嚴格控制醒發條件，經歷長時間的恒溫處理，使生產過程更加簡便易于操作[6]，提高生產效率，降低成本，具備研究意義。Mattice等[7]發現有機酸的預處理可提高玉米醇溶蛋白延展性，優化網絡結構，但未做進行應用研究。以乳酸預處理玉米醇溶蛋白為蛋白質基制備面團，研究其流變特性和微觀結構，具有探究意義。在谷物面團的醒發環節，微生物通過自身代謝，促使面團富集乳酸[8]。作為食物中常見天然成分，將乳酸應用于食品中，具有較高的相容性[6]。

本研究以玉米醇溶蛋白、玉米淀粉和沙蒿膠為原料，構建玉米醇溶蛋白基無麩質面團。選用乳酸作為玉米醇溶蛋白基無麩質面團調控用酸，采用兩種乳酸引入方式，設置乳酸添加組（T面團）和乳酸預處理玉米醇溶蛋白組面團（C面團），探討玉米醇溶蛋白基無麩質面團中乳酸和玉米醇溶蛋白比例（L/Z比）對面團流變性質及面團中玉米醇溶蛋白微觀結構的影響規律。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳酸 分析純，上海麥克林生化科技有限公司；玉米醇溶蛋白 西格瑪里奧德里奇（Sigma-Aldrich）公司，貨號Z3625；沙蒿膠 上海源葉生物科技有限公司；玉米淀粉 黑龍江鵬程生化有限公司，直鏈淀粉含量24.49%±1.41%，支鏈淀粉含量75.87%±1.90%；實驗用水 均為蒸餾水。

DT2000電子天平 常熟市嘉衡天平儀器有限公司；AB-SF16A和面機 珠海市北美電器（珠海）有限公司；Phycica MCR 301流變儀 奧地利安東帕（Anton Paar）有限公司；Extensograph-E拉伸儀 德國布拉班德（Brabender）公司；FD-1C-80真空冷凍干燥機 海市比郎儀器制造有限公司；SIGMA HD掃描電子顯微鏡 德國蔡司（Carl Zeiss Microscopy GmbH）公司；LUMPOS獨立式紅外顯微成像系統德國布魯克（Bruker）公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸預處理玉米醇溶蛋白制備 將玉米醇溶蛋白分別置于梯度濃度乳酸水溶液中，乳酸和玉米醇溶蛋白比例分別為0:10、1:10、2:10、3:10、4:10、5:10（v/w），混合均勻。于25 ℃下混合靜置6 h，使其充分反應。于40 ℃的烘箱中使之干燥，打粉過篩，得到乳酸預處理玉米醇溶蛋白。取少量蛋白質，用水進行多次揉搓洗滌。根據徐偉等[9]檢測方法，通過液相測取洗滌用水中乳酸含量，計算推導出乳酸預處理玉米醇溶蛋白中殘留乳酸含量。

1.2.2 玉米醇溶蛋白基面團制備

1.2.2.1 乳酸添加組面團（T面團） 將玉米醇溶蛋白、沙蒿膠和玉米淀粉按10:1:39（w/w/w）的比例充分混合，作為面團原料。加入乳酸水溶液，經和面機揉混5 min后，用壓面機對折碾壓8次，制得面團中乳酸和玉米醇溶蛋白比例（L/Z比）為1:10、2:10、3:10、4:10、5:10（v/w），分別記為T0、T1、T2、T3、T4、T5。置于自封袋中，25 ℃下靜置30 min消去面團中應力后，進行后續檢測。

1.2.2.2 乳酸處理組面團（C面團） 將乳酸預處理玉米醇溶蛋白、沙蒿膠、玉米淀粉按10:1:39（w/w/w）的比例充分混合，作為面團原料。為保證制得面團中L/Z比為1:10、2:10、3:10、4:10、5:10（v/w），需補充少許乳酸，加蒸餾水，和面機揉混5 min后，用壓面機對折碾壓8次，分別記為C0、C1、C2、C3、C4、C5。

1.2.3 動態流變學檢測 用流變儀，分別測定不同L/Z比的T和C面團動態流變特性。參考Girard等[10]的方法，取面團中心部分，置于流變檢測臺上，平板間距2.0 mm，設定實驗溫度25 ℃。待平板壓下后，用塑料刮刀切去樣品延展于平板外的多余部分，并在樣品邊緣滴加些許硅油，抑制測試過程中樣品的水分散失。在動態測量模式下，確定頻率為1 Hz時，面團處于線性黏彈區域內，檢測中面團結構不被破壞。根據頻率掃描程序測定面團的動態流變學性質，設定掃描頻率為0.1~10 Hz，對面團儲能模量（G′）、損耗模量（G′′）和損耗系數（tanδ）隨掃描頻率的變化進行測定。

1.2.4 拉伸實驗 參考魏益民等[11]的方法，并略作調整。通過Brabender拉伸儀，系統地測定了T面團的拉伸性能。

1.2.5 掃描電鏡觀測 參考Wang等[12]的方法。將不同L/Z比的T面團和C面團，進行真空冷凍干燥，挑取截面平整的凍干面團固定于樣品臺上，用離子濺射儀對表面噴金，于2 kV加速電壓下，放大1000倍進行觀測。

1.2.6 紅外顯微成像分析 參考Wang等[13]的方法。在紅外顯微成像系統的衰減全反射（ATR）模式下，對凍干后的T面團和C面團，進行蛋白質分布分析。選取較為平滑的面團截面，實施隨機面陣采樣。設空氣為參比背景光譜，光譜分辨率4 cm?1，波數范圍為4000~600 cm?1，采集紅外光譜圖成像面積為375 μm×375 μm，空間分辨率25 μm×25 μm。對酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ區1715~1484 cm?1的峰進行積分，得到能夠表示面團中蛋白質分布的2 D偽彩圖[14?15]。

1.3 數據處理

所有實驗至少重復2次，平行3次，結果以均值±標準方差表示。基于SPSS 21軟件對數據進行方差分析（ANOVA），置信區間P<0.05。使用Origin2018軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 動態流變特性

G′反映面團彈性；G′′反映面團黏性；tanδ=G′′/G′，是綜合表征面團粘彈性的指標[16]。由圖1可知，兩組面團的G′和G′′值均受制于振蕩頻率，具有典型的黏彈性流體特征[17]；G′值遠高于G′′值，tanδ<1，機械特征以彈性為主[18]。比較發現，T0和C0間的G′、G′、tanδ無明顯差異，但相等L/Z比的T和C面團的G′、G′′、tanδ數值差異明顯。

圖 1 不同L/Z比的T面團和C面團動態流變檢測Fig.1 Dynamic rheological detection of T dough and C dough with different L/Z ratios

乳酸的添加，影響到玉米醇溶蛋白的結構狀態，使面團黏性增加，強化了T面團的流體特征。圖1中，隨L/Z比增加，T面團的G′和G′′逐漸下降，tanδ逐漸上升。T5的G′和G′′分別降至T0的22.59%和38.65%，而T5的tanδ上升至T0的1.71倍，是因為添加乳酸引起面團彈性和黏性的下降，但黏性下降程度遠小于彈性，使tanδ上升，即面團流體特征增強，更適于加工操作。在酸化小麥面團的研究中，同樣發現有機酸會導致面團硬度下降，測得G′、G′′值減小[19?20]。研究認為酸性環境會影響玉米醇溶蛋白構象，進而導致面團G′和G′′發生下降[21]；增加黏性基團占比，使面團的tanδ上升[22]。

不同的乳酸引入方式，造成了T和C面團之間流變性質的差異。相比C面團，T面團更具黏性特征。L/Z比一定時，T面團有更小的G′和G′′，更高的tanδ，但這種差距隨L/Z比增加而減小。如T1的G′和G′′，分別僅是C1的19.98%和31.64%，而T5的G′和G′′，分別為C5的34.51%和56.19%。

C面團的G′、G′′，同樣會隨L/Z比的增加而逐漸上升，且變化幅度較大。少量的乳酸，強化了面團粘彈性特征，使面團在宏觀上更趨向于固體[23]，C1的G′和G′，分別為C0的2.70和2.16倍。但隨L/Z比持續提高，面團G′和G′′逐漸下降，C5的G′和G′′分別降至C0的71.40%和68.79%。C面團的tanδ隨L/Z比的增加而逐漸上升，但均低于C0。C1的tanδ僅為C0的80.23%，而C5的tanδ與C0基本相等。乳酸含量對C面團動態流變性能的影響規律可能與預處理過程中玉米醇溶蛋白的脫酰胺反應及蛋白質水解有關[7]。

2.2 拉伸特性

C0與T0拉伸性無顯著差異（P>0.05），C1~C5則可能因tanδ較小，黏性占比低，面團拉伸性能不足，而無法有效實驗。本實驗僅對T面團進行了系統的拉伸性檢測，探討L/Z比對玉米醇溶蛋白基面團拉伸性的影響。

拉伸能量反映了面團筋力，與谷物的烘焙品質正相關[24]。拉伸阻力代表了面團的韌性和筋力；延展性代表了面團的延展能力和可塑性[23]。拉伸比值是對面團拉伸阻力和延展性的質量綜合評價[25]，拉伸比大的面團，具備較好的醒發持氣性[26]。

Sly等[4]手動進行了拉伸實驗，提出隨乳酸含量增加，玉米醇溶蛋白基面團延展性提高，拉伸距離增加。本實驗采用更專業的拉伸性檢測設備，全面地分析了拉伸性相關參數。發現調價乳酸比例可以實現對T面團拉伸性的雙向調控。在一定范圍內，增加L/Z比（T1~T3），強化了面團拉伸性能，但過量的乳酸（T4、T5）會弱化面團的拉伸性，導致筋力和延展性明顯下降（P<0.05）。由表1可知，面團的拉伸能量、拉伸阻力、拉伸距離、拉伸比值，隨L/Z比增加，均呈先上升后下降趨勢，且反映面團拉伸指標的峰值，多數集中于T2。在有機酸對小麥面團拉伸性的研究中認為適量的有機酸在一定程度上能夠弱化面團，有利于增加面團的拉伸性能[19?20]。對于玉米醇溶蛋白基面團來說，適量的乳酸同樣增加了面團的拉伸性能，但過量的酸會對蛋白質結構造成破壞，使反映面團拉伸性能的各指標下降。隨L/Z比增加（T0~T2），T面團拉伸性變化規律與動態流變結果有所出入，這是因為體系中的H+會抑制玉米醇溶蛋白的聚集[27]，添加乳酸，使面團中H+濃度增加，蛋白質分子間、分子內靜電斥力增大，玉米醇溶蛋白結構柔性增強，在外力作用下，易于舒展，使面團強度減小，G′和G′′下降。與此同時，玉米醇溶蛋白將原本被卷覆與結構內部的疏水性基團暴露在外，分子間通過疏水性相互作用聯接成網，增強了面團延展性。但隨著L/Z比（T3~T5）的進一步提高，面團H+濃度增大逐漸抵消了疏水性相互作用對面團拉伸性的積極作用，造成T面團拉伸性的下降。

表 1 T0~T5的拉伸性Table 1 Stretchability of T0~T5

2.3 掃描電鏡觀測

制作無麩質黏彈性面團的關鍵，是構建面團的功能性骨架，形成連貫結實的蛋白質網絡[28]。在圖2和圖3中可觀察到，T0和C0中的玉米醇溶蛋白均形成了連續的蛋白質相，但聚集嚴重，分布不均，主要以聚集團塊的形式存在。但添加乳酸后，T和C面團中玉米醇溶蛋白均構建起網狀結構，如圖2、圖3，紅色箭頭所標注的面團中玉米醇溶蛋白網絡。可見乳酸能夠減小面團中的玉米醇溶蛋白聚集程度，抑制玉米醇溶蛋白聚集成塊，促進玉米醇溶蛋白的聯結成網。同時，由于乳酸引入方式不同，隨L/Z比增加，T和C面團中玉米醇溶蛋白網絡的變化趨勢存在差異。

乳酸能夠調控T面團中玉米醇溶蛋白的網絡狀態，隨L/Z比增加，玉米醇溶蛋白網絡連貫均一性呈先提高后下降趨勢，與拉伸性能的變化規律近似。由圖2的T0到T5 SEM畫面可知，玉米醇溶蛋白的聚集程度逐漸下降。是因為H+會抑制玉米醇溶蛋白的聚集[27]，隨面團中H+含量增加，蛋白質分子內/間排斥力增強，玉米醇溶蛋白組分整體變軟，在揉混作用下易于在面團中分布均勻。T面團G′和G′′值隨L/Z比增加而逐漸下降也可能與玉米醇溶蛋白組分變弱有關。對比發現，T0、T1中玉米醇溶蛋白發生明顯聚集，呈團塊狀。T2中未觀測到團塊狀的玉米醇溶蛋白，而是以連續且均一的蛋白質網絡的形式存在。隨L/Z比進一步增加，T3、T4、T5中玉米醇溶蛋白網絡結構特征下降，逐漸變得稀薄。雖然從圖2的T4、T5畫面中可以辨析出玉米醇溶蛋白網絡，但網狀質量較差，對玉米淀粉的包裹程度明顯下降。結合拉伸實驗的結果，認為適量的乳酸可促使玉米醇溶蛋白在面團中構建起結實均一的網絡，提高面團拉伸性，如T2中玉米醇溶蛋白網絡狀態最佳，拉伸性能突出，但隨面團中L/Z比的繼續增加，玉米醇溶蛋白網絡被顯著弱化，拉伸性也隨之下降。

圖 2 T0~T5 SEM圖像（1000×）Fig.2 SEM images of T0~T5（1000×）

圖 3 C0~C5 SEM圖像（1000×）Fig.3 SEM images of C0~C5（1000×）

由圖3中C1~C5的SEM畫面可知，在引入乳酸后，面團中玉米醇溶蛋白以兩種特征狀態存在，一種是形成絲網狀的蛋白質相，附著于玉米淀粉表面，另一種是聚集為蛋白質團塊，未與體系中的玉米淀粉發生明顯的物理結合。隨L/Z比的增加，由玉米醇溶蛋白形成的絲網愈發松散、薄弱，面團中的玉米醇溶蛋白團塊的個體粒徑減小，C5中不再出現蛋白質團塊。谷氨酰胺占玉米醇溶蛋白總氨基酸含量的20%以上[29]。有研究表明，有機酸會引發蛋白質的脫酰胺反應，將部分疏水性的谷氨酰胺，轉為親水性的谷氨酸[30]，使玉米醇溶蛋白的疏水性下降，弱化了蛋白質分子間基于疏水相互作用的結合強度[29]。在小麥面筋蛋白與檸檬酸的脫酰胺反應研究中發現，處理過程中的檸檬酸水溶液濃度越高，蛋白質脫酰度越大[31]。同T面團一樣，C面團中的玉米醇溶蛋白也可以通過分子間疏水相互作用彼此聯結，但由于乳酸預處理過程中，玉米醇溶蛋白與乳酸的充分反應，且脫酰胺度會因乳酸濃度增加而提高，導致玉米醇溶蛋白間疏水作用力減弱，因而在面團揉混過程中，無法在機械作用下構建起連貫的蛋白質網絡，僅能夠形成松散的團塊及薄弱的絲狀網帶。同時，脫酰胺反應還會造成蛋白質的肽鍵斷裂[32?33]，蛋白質的相對分子質量減小，同樣不利于網絡的構建。

對比圖2、圖3認為，兩種乳酸引入的方式，使存在于T和C面團中的玉米醇溶蛋白形態差異明顯。T面團中的玉米醇溶蛋白網絡較為連貫，結構特征明顯，與淀粉結合更為緊密。而C面團中，玉米醇溶蛋白網絡質量較差，呈絲線狀，部分以團塊狀聚集體形式存在，蛋白質分布不均，對淀粉的裹覆程度低，這可能是C面團拉伸性差，無法有效進行拉伸實驗的重要原因。

2.4 紅外顯微成像分析

紅外顯微成像（FTIR-M）的檢測結果是2D偽彩圖，直觀地反映了面團中蛋白質的分布情況[34]。有助于在SEM觀測基礎上，進一步分析面團中玉米醇溶蛋白的存在狀態。結合軟件提供的色度條輔助比較，偽彩圖中各顏色所標注區域的蛋白質信號強度依次為白色>紫色>紅色>黃色>綠色>藍色，信號越強表示該區域內蛋白質的含量越高[13]。若紅色區域在畫面中分布廣泛，且藍色等暗色區域較少，認為面團中蛋白網絡形成充分，分布均勻[15]。

在小麥面團的研究中認為，連貫的蛋白質網絡結構可賦予面團良好的質構性能[35]。與小麥面團相似，較強的玉米醇溶蛋白網絡結構能賦予面團良好的質構性能，網絡的弱化則會造成面團質構性能的下降。通過探究乳酸引入方式，改變L/Z比，影響面團中玉米醇溶蛋白網絡狀態，進而實現對面團質構性能的調控。與圖2的T面團SEM觀測結果相應。在圖4 T0的偽彩圖中，表示玉米醇溶蛋白信號的亮色區域，高度集中，認為面團中的玉米醇溶蛋白聚集團塊嚴重，未能很好地融入到體系中。隨乳酸的添加，T1~T3偽彩圖中高亮色區域的黃色、綠色面積增大，更為均一地分布于畫面中，而代表蛋白質信號微弱的藍色區域占比逐漸減少。隨L/Z比繼續提高，T4、T5偽彩圖中，表示玉米醇溶蛋白紅外信號較強的紫色、紅色等高亮色區域占比減小；黃色、綠色區域內出現藍色斑塊；藍色部分的占比逐漸增加。

圖 4 T0~T5的T面團紅外顯微成像Fig.4 FTIR-M images of T0~T5

圖 5 C0~C5的紅外顯微成像Fig.5 FTIR-M images of C0~C5

分析認為，少量的乳酸，會促使玉米醇溶蛋白結構舒展，蛋白質彼此聯接成網，有利于玉米醇溶蛋白以網絡形態，均勻地分布于面團中。結合拉伸實驗結果，推測正是這種結實而連貫的玉米醇溶蛋白網絡結構，使T2具備更大的拉伸能量和拉伸阻力。如果乳酸比例太高，在促使玉米醇溶蛋白自身結構舒展的同時，也抑制了蛋白質的相互聯接，蛋白質間相互作用減弱，玉米醇溶蛋白網絡變得稀薄，強度下降。

結合圖3觀測結果，C0的偽彩圖（圖5）進一步證明，在不含乳酸的C面團中玉米醇溶蛋白聚集為塊。在C1、C2、C3偽彩圖中，存在一定的高亮色區域，但相比T1~T3面團，范圍較小，趨于離散，藍色區域面積較大。說明面團中的玉米醇溶蛋白，隨乳酸增加，聚集程度降低，但未形成結實的網絡。隨著L/Z比增加，C4、C5中的高亮色區域面積逐漸減小，變為小斑塊；藍色部分占比較大。結合SEM觀測結果，認為此時玉米醇溶蛋白，發生嚴重水解，使紅外信號減弱。C面團的乳酸引入方式，使玉米醇溶蛋白疏水相互作用較弱，難以形成網絡，趨于分散。面團表現出較小的黏性，玉米醇溶蛋白網絡呈絲線狀，且無法進行有效拉伸。

3 結論

乳酸可通過調節玉米醇溶蛋白網絡狀態，影響玉米醇溶蛋白基無麩質面團質構特性。乳酸和玉米醇溶蛋白比例（L/Z）增加，導致乳酸添加組和乳酸預處理玉米醇溶蛋白組面團黏度提高，流體特征增強。但在L/Z比一定時，兩種面團流變性差異顯著（P<0.05），添加組面團更具黏性，G′、G′′小于預處理組面團，tanδ大于預處理組面團。改變L/Z比可以調控添加組面團的拉伸性能與玉米醇溶蛋白網絡狀態。隨L/Z比增加，添加組面團的拉伸性能呈先上升后下降趨勢，與玉米醇溶蛋白網絡結構特性變化規律一致。L/Z比為2:10的添加組面團中，玉米醇溶蛋白網絡結構連貫，分布廣泛，對淀粉顆粒裹覆充分，面團拉伸性能良好。預處理組面團的乳酸引入方式，不利于玉米醇溶蛋白網絡的構建，蛋白質趨于離散，玉米醇溶蛋白網絡結構特征隨L/Z比增加而降低，面團無法進行有效拉伸，而添加組面團具備實際應用潛力，有待進一步優化。