娃娃菜（Brassica campestris）軟腐病病原菌的分離與鑒定

趙歡歡，張元元，張映曈，胡花麗，周宏勝，羅淑芬，李鵬霞,,3,

（1.南京農業大學食品科技學院，江蘇南京 210095；2.江蘇省農業科學院農業設施與裝備研究所，江蘇南京 210095；3.江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇南京 210095）

娃娃菜（Brassica campestris）屬于十字花科蕓薹屬，是一種小型白菜，外形精巧、口感細膩、風味清新。娃娃菜營養價值極高[1]，糖類、蛋白質、維生素、膳食纖維等含量豐富，鈉、鉀含量幾乎是大白菜的2~3倍[2]，深受消費者歡迎，因此，娃娃菜的需求量與日俱增。但娃娃菜組織脆嫩、含水量高、葉表面積大，在采后運輸及貯藏過程中極易遭受機械損傷[3]，病原菌易從傷口處侵入，從而誘發各種病害，給娃娃菜產業帶來了嚴重的損失。軟腐病是導致娃娃菜采后品質劣變的一種最常見的細菌性病害[4]。軟腐病發生時，起初由根莖部或葉部開始發病，病斑呈水漬狀，半透明，并迅速向四周擴散蔓延，隨后病斑開始流出黃色膿液，并散發出硫化氫的臭味，娃娃菜開始腐爛塌陷，徹底失去食用價值[5]，造成了嚴重的經濟損失[6]。因此，亟需對引起娃娃菜軟腐病的病原菌進行分離鑒定并采取相應的防控措施，以期減少娃娃菜采后軟腐病的發生。

植物細菌性軟腐病在世界各地廣泛發生，主要是由腸桿菌科（Enterobacteriaceae）的果膠桿菌屬（Pectobacterium）和迪基氏菌屬（Dickeya）侵染引起的[7]。Pectobacterium目前包括P.carotovorum（Pc）、P.atrosepticum（Pa）、P.betavascularum（Pb）和P.wasabiae（Pw）4個種，其中Pc又被進一步劃分為P.carotovorumsubsp. carotovorum（Pcc）、P.carotovorumsubsp. odoriferum（Pco）和P.carotovorumsubsp. brasilience（Pcb）3個亞種[8,9]。Pco在全世界范圍內寄主種類廣泛，它通過產生和分泌果膠酶和纖維素酶等細胞壁降解酶，破壞蔬菜、花卉和大田經濟作物等多種植物的細胞壁，最終導致植株腐爛死亡[10]。Li等[11]的研究表明，與Pc的其他亞種相比，被Pco侵染的植株損傷更為嚴重。Waleron等[12]首次發現Pco能夠侵染菊苣葉，造成軟腐病。隨后，王茜等[13]發現Pco也是導致芹菜軟腐病的主要病原菌，患軟腐病的芹菜，其莖和葉柄腐爛，并發出刺鼻的惡臭，植株完全癱軟，徹底失去食用價值。晉知文等[14]也得出了類似的結果。此外，研究人員從大白菜[15]、甘薯[16]、菜花[17]和馬鈴薯[18]等軟腐病株中也分離鑒定出了Pco，但有關娃娃菜采后軟腐病的病原菌種類尚未見報道。

因此，本研究擬以新鮮娃娃菜為研究對象，選取典型軟腐病病癥葉片進行菌株的分離純化、致病性測定、形態觀察、生理生化鑒定、16S rDNA分析和特定基因序列測定，以期明確引起娃娃菜軟腐病病原菌。研究結果將加深對娃娃菜軟腐病致病機制的理解，同時為采取有針對性的防治措施奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮“耕野”娃娃菜 于2019年6月份購自南京眾彩蔬菜批發市場，挑選大小均一、無明顯機械損傷的娃娃菜作為試驗材料，于常溫貯藏一定時間至發病；氯化鈉 分析純，上海久億化學試劑有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、戊二醛 分析純，上海麥克林生化科技有限公司；草酸銨結晶紫染液 上海如吉生物科技發展有限公司；番紅染液 北京華越洋生物；碘液 北京索萊寶科技有限公司；NA、LB培養基 上海盛思生化科技有限公司。

M603Di型電子天平 意大利Bel公司；SYQDSX-280B高壓滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；恒溫培養箱 日本Sanyo公司；東勝·升PCR儀 南京十字架生物科技有限公司；SW-CJ-1B型凈化工作臺蘇州凈化設備有限公司；THZ-82氣浴恒溫振蕩器金壇市醫療儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 病原菌的分離與純化 參照鄭學立等[19]的方法并略作改動。用無菌袋采集典型軟腐病癥狀的發病植株莖葉，在無菌袋中加入一定量生理鹽水（固液比1:4），放入搖床，200 r/min，30 ℃振蕩20 min，稀釋至合適濃度，涂布于PCA平板，30 ℃培養24 h后，根據菌落形態挑取單個菌落進行純化培養。

1.2.2 病原菌致病性測試 參照孫齊英等[20]的方法并略作修改。試驗材料為新鮮健康無損傷的娃娃菜莖段（長4~5 cm，寬2~3 cm），用75%酒精擦拭消毒，置于無菌培養皿中，下襯一張無菌濾紙，并加入2 mL無菌水保持濕潤。用滅菌小刀在莖段中心位置劃2 mm×2 mm的十字型傷口，深度為1.5 mm左右。將純化后的菌株用0.85%的無菌生理鹽水洗滌3次，制備成濃度為105CFU/mL的菌懸液，滴加10 μL到植物十字型傷口中，每株菌15個平行。用封口膜密封后，放置于30 ℃培養箱，每隔5 h觀察記錄發病情況，同時設置0.85%無菌生理鹽水作為陰性對照。

1.2.3 病原菌形態學鑒定

1.2.3.1 菌落的形態觀察 采用三區劃線法將致病菌株劃線接種到NA平板上進行培養，在30 ℃條件下培養24 h，觀察并記錄單菌落的形態大小、顏色深淺、邊緣是否光滑、透明度、菌面是否凸起、是否有莢膜等情況[21]。

1.2.3.2 掃描電鏡觀察 參照陳欣[22]的方法并略做改動。樣品細胞以6000×g，4 ℃下離心后沉淀，用PBS溶液（0.2 mol/L，pH7.2）洗滌2次，用1 mL 4 ℃預冷過含有2.5%戊二醛的PBS溶液固定8 h以上。然后用PBS溶液（0.2 mol/L，pH7.2）沖洗3遍，加入1%鋨酸靜置4 h，再用無水乙醇脫水、乙酸異戊酯置換、CO2臨界點干燥、離子金濺射鍍金后，置于場發射掃描電子顯微鏡（EVO-LS10）下觀察分析。

1.2.3.3 革蘭氏染色反應 參照譚嘯等[23]的方法并略作改動。在載玻片上滴一滴滅菌水，用接種針蘸取少量單菌落，于水中將菌體輕輕打散，放入30 ℃烘箱中風干固定，經草酸銨結晶紫染液初染、乙醇脫色、番紅染液復染后，于顯微鏡下觀察菌體染色情況及形態。

1.2.4 生理生化鑒定分析 對致病菌株進行生理生化鑒定，鑒定項目包括King’s B培養基、結晶紫果膠酸鹽培養基（CVP）上生長、明膠液化、37 ℃生長、5%和7% NaCl生長、檸檬酸鹽利用、糖醇發酵和產酸檢測。具體方法參照《常見細菌系統鑒定手冊》[24]。

1.2.5 16S rDNA分析 采用FastPure Bacteria DNA Isolation Mini Kit試劑盒提取細菌總DNA。用16S rDNA序列通用引物對細菌總DNA進行擴增，反應終止后，取PCR產物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。將擴增片段經膠回收后，送南京思普金生物科技公司測序。

將測序結果在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）數據庫中進行BLAST比對分析。基于NCBI中已發表的Pectobacterium的16S rDNA序列，以及本實驗獲得的兩株病原菌C-2和C-11的16S rDNA序列，使用MEGA 7軟件采用UPGMA法構建系統發育樹。

1.2.6 果膠酶基因序列測定 用果膠桿菌果膠酶基因擴增引物對細菌總DNA進行擴增。果膠酶基因擴增上游引物PccF為：5’-TTACCGGAGCCCGAGC TGTGGCGT-3’，下游引物PccR為：5’-CAGGAAGAT GTCGTTATCGCGAGT-3’，預計擴增片段約為450 bp。PCR擴增體系（20 μL）：DNA擴增模板2 μL，2×Mix 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，ddH2O 6 μL。果膠酶基因擴增條件：94 ℃預變性5 min；循環參數：94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共30個循環；72 ℃延伸10 min。反應終止后，取PCR產物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。將擴增片段經膠回收后，送南京思普金生物科技公司測序。

1.3 數據處理

采用Excel2010作表，MEGA 7軟件構建系統發育樹。所有試驗均進行3次重復。

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離和致病性

將娃娃菜軟腐病株進行處理，稀釋均質液并涂布于培養平板上。挑取不同菌落形態的優勢菌株，并將其純化保存。三個批次共獲得17株優勢菌株，命名為A-1~A-3、B-1~B-3和C-1~C-11。

將分離出的17株菌的菌懸液接種到新鮮娃娃菜莖段上，33 h后，接種C-2和C-11的娃娃菜莖段上的病斑直徑分別為31.6和40.2 cm，呈水漬狀腐爛，且伴有惡臭，符合軟腐病癥狀，而其他菌株均無強致病性，也不產生水漬狀病斑（圖1A）。

將C-2和C-11接種至室溫貯藏的整顆娃娃菜基部，8 h時軟腐癥狀的病斑從傷口處擴散，隨著時間的延長，病斑面積逐漸擴大，基部腐爛塌陷，并發出惡臭（圖1B），表明C-2和C-11均具有致病性。

圖 1 C-2和C-11對娃娃菜離體（A）和活體（B）的致病性Fig.1 Pathogenicity of C-2 and C-11 in vitro (A)and in vivo (B)

2.2 病原菌的形態學鑒定結果

由圖2A、圖2B可以看出，病原菌C-2和C-11在LB培養基上呈乳白色圓形菌落，稍凸起，有光澤感，半透明，邊緣圓潤。菌體形態見電鏡圖2C、圖2D，其基本特征為：菌體呈短桿狀，兩端鈍圓，周生鞭毛。革蘭氏染色結果表明，這兩株菌均為革蘭氏陰性菌（圖2E、圖2F）。這一結果符合Pectobacterium的特性[25]。

2.3 生理生化特征

通過生理生化指標鑒定（表1），發現C-2和C-11的生理生化指標測定結果均符合Pc的特性[11,26]，C-2和C-11適宜在37 ℃生長，且可利用檸檬酸鹽和明膠，這與Pa和Pw需在37 ℃以下生長及Pb無法利用檸檬酸鹽和明膠的特性不同[9,27?28]，因此，可以初步證實C-2和C-11屬于Pc種。C-2和C-11均能夠利用山梨醇發酵產酸，這與已發表的Pco菌株的特性相符[12]，而Pcc和Pcb亞種則無法利用山梨醇。

2.4 16S rDNA分析及系統發育樹構建結果

為了進一步明確C-2和C-11的分類地位，對其進行分子生物學的鑒定。收集C-2和C-11菌體，提取基因組DNA，以其為模板，采用16S rDNA通用引物進行擴增。擴增片段電泳結果如圖3所示，得到的PCR產物大小均在1500 bp左右，符合預期長度。將目的片段進行膠回收，送測序公司測序。測序結果顯示，C-2和C-11的16S rDNA基因序列全長為1428 bp和1434 bp。

圖 2 菌株C-2（左）和C-11（右）的形態觀察結果Fig.2 Morphological observation results of C-2 (left)and C-11 (right) strains

圖 3 C-2和C-11 16S rDNA序列PCR擴增產物電泳圖Fig.3 Electrophoretogram of PCR products for the 16S rDNA sequences of C-2 and C-11

采用ClustalX比對C-2和C-11的16S rDNA基因序列，結果表明兩個序列高度同源，僅在第31、432、472、481、1281和1401位堿基處有差異。將C-2和C-11的16S rDNA基因序列在NCBI數據庫上（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）進 行BLAST比對，結果顯示菌株C-2（GenBank Accession No.MW 658361）和C-11（GenBank Accession No.MW658362）與多株Pc菌株顯示較高同源性，其中C-2與PcPZ12菌株（GenBank Accession No.MN394034.1）同源性高達99.93%，C-11與PcY16菌株（GenBank Accession No.KP187496.1）同源性高達99.93%。因此C-2和C-11鑒定為腸桿菌科（Enterobacteriaceae）的果膠桿菌屬P.carotovorum（Pc）種。釆用MEGA 7軟件以16S rDNA相似序列構建系統發育樹。結果如圖4所示，菌株C-2與C-11與已發表的Pc株系親緣關系較近，首先與Pco菌株聚類形成了Pco類群，Pco類群與Pcc和Pcb類群又聚類形成了Pc分枝。系統發育結果進一步證實了導致娃娃菜采后軟腐病的病原菌屬于Pco亞種，為娃娃菜軟腐病的防治提供了理論依據。

2.5 果膠酶基因序列測定結果

果膠酶基因是胡蘿卜軟腐果膠桿菌亞種的特異性基因[29]，為進一步確認16S rDNA的鑒定結果，以C-2和C-11的基因組為模板，擴增特異性果膠酶基因，電泳結果見圖5。將目的片段膠回收，并送測序公司測序。結果顯示，片段長度分別為403 bp和407 bp，符合預期長度。在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）數據庫中進行BLAST比對，結果表明：C-2和C-11的果膠酶基因序列同源性為99%，且與Pc菌株EC4（GenBank Accession No.X16397）序列同源性達98.5%。

圖 4 基于C-2和C-11菌株基因序列構建的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on gene sequence of strain C-2 and C-11

圖 5 C-2和C-11的果膠酶基因序列PCR擴增產物電泳圖Fig.5 Electrophoretogram of PCR products for the pectinase gene sequences of C-2 and C-11

表 1 C-2和C-11生理生化指標結果Table 1 Identification results of physiological and biochemical indexes of C-2 and C-11

3 結論

本研究從患軟腐病的娃娃菜中分離得到的菌株進行致病性測試，發現只有接種菌株C-2和C-11的娃娃菜病斑呈水漬狀，葉片粘稠，流出黃色膿狀液體，并伴有惡臭，這與Waleron等[12]發現的菊苣軟腐病的典型癥狀一致。

通過生理生化鑒定，發現C-2和C-11是革蘭氏陰性菌，菌體呈短桿狀。與Pa和Pw菌株在低于37 ℃條件下的生長特性以及Pb菌株不能利用檸檬酸鹽和明膠的特性不同，C-2和C-11可在37 ℃和含有7%NaCl培養基中正常生長，可利用檸檬酸鹽和明膠，并能夠利用葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油、半乳糖、水楊苷、麥芽糖、甘露醇和山梨醇作為碳源發酵產酸，這與已發表的Pco菌株表現一致[13]。研究表明，Pc可通過傷口侵入植物體內，產生高水平的胞外酶，如果膠裂解酶（pectate lyase，Pel）、聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，Peh）和纖維素酶（cellulase，Cel）等，進而破壞植物細胞壁[22]，使植物組織呈水漬狀腐爛，并散發出刺鼻的氣味。C-2和C-11在CVP培養基上能夠產生典型的杯狀凹陷，表明其具有利用果膠的能力，這與報道的Pco致病機理一致[12]。

16S rDNA序列測定、果膠酶序列同源性及系統發育樹的構建進一步證明了以上結果。首先，通過測序發現C-2和C-11菌株16S rDNA序列準確長度為1428 bp和1434 bp，為16S rDNA基因的完整序列。其次，C-2和C-11的果膠酶基因序列與Pc菌株EC4（GenBank Accession No.X16397）序列同源性為98.5%。最后，將C-2和C-11的16S rDNA序列與已發表的軟腐果膠桿菌菌株構建系統發育樹。結果表明，菌株C-2和C-11與Pco菌株聚類形成了Pco類群，Pco類群與Pcc和Pcb類群又聚類形成了Pc分枝。而Pa、Pb和Pw菌株聚類后形成另外的分支。綜合多種鑒定結果，C-2和C-11被鑒定為胡蘿卜軟腐果膠桿菌Pco亞種。

綜上，本研究通過對娃娃菜軟腐病株中致病菌的分離、致病力測試、革蘭氏染色、電鏡圖觀察、生理生化鑒定、16S rDNA序列鑒定、果膠酶基因序列測定分析和系統進化樹構建等多種方式，確定了導致娃娃菜軟腐病的主要致病菌為胡蘿卜軟腐果膠桿菌亞種Pectobacterium carotovorumsubsp. odoriferum（Pco），這一結果為有針對性地開展對該病害的綜合控制技術提供了理論依據。