鄉村自然發酵豆腐乳的真菌多樣性研究

巫婷玉，徐芳玲 ，葉蔚歆，虞春華，馬 嫚，陳 曄

（1.江西醫學高等專科學校基礎醫學部，江西上饒 334000；2.九江學院藥學與生命科學學院，江西九江 332000；3.廣東省農業科學院，廣東廣州 510000）

豆腐乳是中國流傳數千年的漢族傳統民間美食，豆腐乳以它的口味鮮美、風味獨特、質地細膩、營養豐富而著稱，被稱之為“東方奶酪”，是我國著名的傳統發酵豆制調味品之一。發酵豆制品的整個生產過程被認為是一個開放的、傳統的過程，整個發酵過程中有多種微生物共同參與，不同微生物所起的作用可能各不相同。

豆腐乳作為發酵食品，目前研究發現豆腐乳中真菌有毛霉屬（Mucor）[1?2]、曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）、根霉屬（Rhizopus）[3]、地霉屬（Geotrichum）、鐮刀孢屬（Fusarium）、毛孢子菌屬（Trichosporon）、畢赤酵母屬（Pichia）、假絲酵母屬（Candida）、酵母屬（Saccharomyces）、耶羅維亞酵母屬（Yarrowia）等微生物[4?6]；微生物在豆腐乳的生產、揮發性風味、品質等方面具有影響，國內外不同地方[7?9]以及不同風味的豆腐乳中微生物多樣性研究[10?12]表明，豆腐乳中具有豐富的真菌資源，如低鹽[13?14]、紅豆腐乳[15]、傳統發酵的豆腐乳[16?17]中的真菌資源均很豐富。

上饒位于江西省東北部，氣候溫濕，適合真菌的生存。由于當地的風俗習慣，每年春節將近家家戶戶都會制作豆腐乳。相對于工廠里具有嚴格的安全管理，家庭自制發酵豆腐乳具有更高的危害性，由于自制豆腐乳開放式的制作環境，豆腐乳中其它雜霉菌和細菌存在的幾率很高。這些霉菌的存在對于豆腐乳風味的形成可能具有一定的有益作用，同時也可能是有害菌株，在發酵過程中產毒，造成多種微量毒素共存的現象[18?22]。因此，為了讓百姓了解自制發酵豆腐乳的危害性，更好地改善自制豆腐乳的品質，本文以自然發酵豆腐乳為材料，采用稀釋平板培養方法，結合形態特征和LSU序列測序進行菌株鑒定探究上饒不同地區豆腐乳真菌的多樣性。研究結果將有助于進一步了解家庭自制自然發酵豆腐乳真菌毒素的檢測，為家庭自制豆腐乳安全性提供科學的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

自然發酵豆腐乳 來自江西上饒市的八個鄉村；分離培養基 虎紅培養基（蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、瓊脂19 g、孟加拉紅0.033 g、氯霉素0.1 g、蒸餾水1000 mL）；純化、保種培養基 PDA培養基。

LT302電子天平、DYY-2C型電泳儀 北京市六一儀器廠；紫外分析儀、HH-4數顯恒溫水浴鍋、基因擴增儀 上海啟前電子科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料采集和處理 于2018年4月分別在江西上饒市八個鄉村進行了自然發酵豆腐乳樣本采集（具體采樣地點為：A：婺源縣溪頭鄉呈川村；B：廣豐區洋口鎮；C：鉛山縣紫溪鄉文山村；D：玉山縣樟村鎮；E：德興市紅山生活區；F：上饒縣田墩鎮；G鉛山縣石塘周邊；H：廣豐區小康城安利小區。在文中圖表用不同英文字母來表示不同采樣點）。在每個采樣點分別采集3家自然發酵豆腐乳放入無菌瓶中（每瓶150 g），并用無菌自封袋密封帶回實驗室于4 ℃保存，對樣品進行處理培養。

1.2.2 真菌分離純化 采用稀釋涂布平板法。樣品稀釋液的制備：準確稱取待測樣品l0 g，放入研缽中，加入90 mL蒸餾水，進行研磨，使微生物細胞分散，再在虎紅培養基上進行涂布，將平板倒置，進行標號，放入25 ℃恒溫培養箱培養5~7 d，每天觀察。做三個平行實驗，每一個平行實驗中每個稀釋濃度涂布五個平板。

當培養基上長出菌絲后，通過不同菌落的形態特征進行區分，用無菌接種針分別挑取不同菌落的菌絲接到PDA培養基上，繼續25 ℃恒溫培養箱中培養3~5 d，進行純化培養，直到獲得單一的菌種[23]。純化得到的菌株進行分離鑒定，并采用甘油管保藏法置于?20 ℃于保存。

1.2.3 真菌的鑒定

1.2.3.1 形態學鑒定 根據菌落的形態、顏色、菌絲和產孢器結構的形態查閱《真菌鑒定手冊》[24]、Barnett & hunter（1998）和Seifert et al.（2011）的分類系統鑒定到屬。

1.2.3.2 分子生物學鑒定 根據菌落的培養特征及微觀特征進行形態型的劃分合并，通過選取具有代表性的形態型菌株，分別刮取在PDA上培養成熟的菌絲，利用氯化芐法提取DNA[25]。采用真菌引物LR0R（5’-GTACCCGCTGAACTTAAGC-3’）和LR5（5’-TTAAAAAGCTCGTAGTTGAAC-3’）對菌株進行PCR擴增LSU片段[26]，獲得的擴增產物送北京擎科生物科技有限公司進行序列測定。測得序列經峰圖檢查并在NCBI中進行同源性比對[27]。確保序列準確性后，將本研究獲得序列和從GenBank數據庫中下載的相關序列利用MEGA 10.1軟件構建系統發育樹。

1.2.4 實驗數據公式

1.2.4.1 菌落總數（colonies number）的計算

式中：C表示某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數；m表示涂布平板時所用豆腐乳的質量，g；M表示稀釋倍數。

1.2.4.2 分離頻率（isolation frequency，IF）的計算

1.2.4.3 Shannon-Wiener指數（H）的計算

式中：pi表示為種i真菌菌株數目與全部真菌菌株數目的比值。

1.2.4.4 Jaccard相似性指數（Cj）的計算[28]

式中：a表示一個地區豆腐乳分離的真菌的屬數；b表示另一個地區豆腐乳分離的真菌的屬數；c表示兩個地區豆腐乳具有的相同真菌屬數；Cj表示兩個地區豆腐乳之間真菌的屬組成的相似程度。

1.3 數據處理

運用Origin75漢化版軟件進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 豆腐乳中菌落數的比較

豆腐乳中每樣品中的菌落數（表1），豆腐乳中的真菌數量較多。在同一稀釋濃度下，不同的地區的豆腐乳中真菌數有較大的差異，在稀釋濃度為10?3時，鉛山縣紫溪鄉文山村、廣豐區洋口鎮、婺源縣溪頭鄉呈川村每克樣品中的菌落數明顯高于其他五個地區；在稀釋濃度為10?4時，鉛山縣紫溪鄉文山村、上饒縣田墩鎮、廣豐區小康城安利小區、婺源縣溪頭鄉呈川村的每克樣品中的菌落數明顯高于其他四個地區；在稀釋濃度為10?5時，鉛山縣紫溪鄉文山村、廣豐區洋口鎮、鉛山縣石塘周邊的每克樣品中的菌落數明顯高于其他五個地區；說明鉛山縣紫溪鄉文山村、廣豐區洋口鎮、鉛山縣石塘周邊三個地區的菌株豐富度較高。

表 1 每克樣品中的菌落數Table 1 Number of colonies per gram of sample

2.2 豆腐乳中真菌主要類群組成

從上饒市八個地區自制豆腐乳樣品中共分離227個菌株，根據形態特征，形態型菌株LSU序列的相似性比較和分子發育分析將227株菌株劃分Aspergillus、Penicillium、Talaromyces等26個分類單元（表2）。從屬級水平的分離頻率來看，以Penicillium（29.04%）、Aspergillus（24.65%）、Talaromyces（22.88%）、Fusarium（10.57%）為優勢菌群；同時可知Penicillium為婺源縣溪頭鄉呈川村、鉛山縣石塘周邊、廣豐區洋口鎮的共同優勢菌群，Talaromyces為廣豐區小康城安利小區和上饒縣田墩鎮的共同優勢菌群，而德興市紅山生活區的優勢菌群為Penicillium和Aspergillum，鉛山縣紫溪鄉文山村的優勢菌群為Aspergillus，玉山縣樟樹鎮的優勢菌群為Fusarium。

表 2 上饒地區自制豆腐乳真菌菌群組成Table 2 Composition of fermented soybean curd fungus in Shangrao area

從種級水平的分離頻率來看：在八個地區中，以Aspergillus niger（12.77%）、Penicillium pulvillorum（11.00%）、Talaromyces albobiverticillius（10.12%）為優勢菌群；在各個地區的優勢類群也有一定的差異，在婺源縣溪頭鄉呈川村以Penicillium pulvillorum（3.08%）、Penicillium citrimum（2.64%）、Fusarium oxysporum（1.76%）為優勢菌群，在廣豐區洋口鎮以Penicillium citrimum（3.96%）、Talaromyces albobiverticillius（2.20%）、Aspergillus niger（2.20%）為優勢菌群，在鉛山縣紫溪鄉文山村以Aspergillus niger（4.41%）、Penicillium pulvillorum（3.52%）、Talaromyces amestolkiae（2.20%）為優勢菌群，在玉山縣樟村鎮 以Fusarium flocciferum（4.41%）、Aspergillus restrictus（2.64%）、Fusarium oxysporum（1.76%）、Bionectriasp.（1.76%）為優勢菌群，在德興市紅山生活區以Penicillium brasilianum（1.32%）、Aspergillus flavus（0.88%）、Fusarium tricinctum（0.88%）優勢菌群，在上饒縣田墩鎮以Penicillium brasilianum（2.64%）、Talaromyces verruculosus（2.64%）、Aspergillus restrictu（2.20%）為優勢菌群，在鉛山縣石塘周邊以Aspergillus niger（2.20%）、Penicillium pulvillorum（2.20%）、Penicillium brasilianum（1.76%）、Fusarium flocciferum（1.76%）為優勢菌群，在廣豐區小康城安利小區以Talaromyces albobiverticillius（2.20%）、Bionectriasp.（1.76%）、Talaromyces allahabadensis（1.32%）為優勢菌群；其中Aspergillus novoparasiticus、Trematosphaeria biappendiculate為 婺 源縣溪頭鄉呈川村特有菌株，Fungalsp.為鉛山縣紫溪鄉文山村特有菌株，Penicillium oxalicum、Penicillium mariae-crucis、Penicilliumsp.、Talaomyces aculeatus為玉山縣樟村鎮特有菌株，Aspergillus flavusvar、Fusarium tricinctum、Meyerozyma guilliermondii為德興市紅山生活區特有菌株，Talaromyces purpureogenus為上饒縣田墩鎮特有菌株，Penicil-lium simplicissimum、Penicillium mariae-crucis、Talaromyces allahabadensis為廣豐區小康城安利小區特有菌株，說明每個地區的環境不同導致了菌落的差異性。

2.3 系統發育樹的構建

從圖1中可以看出明顯分為三個進化分支，其自展值各為99%；其中菌株D011與Meyerozyma guilliermondiiKY108543單獨劃為一支，兩者的自展值為99%，具有較高的相似性。菌株D001、Y007、Y036聚集在一支歸屬于Fusarium，另外菌株Y042與Bionectriasp. DQ327624.1具有99%的自展值；Aspergillus、Penicillium、Talaromyces、Trematosphaeria劃為一支，均屬于散囊菌目的絲孢發菌科mitosporicTrichocomaceae；其中菌株R007、R001、Y009、Y019、1K004以及W009聚集為一支歸屬于Talaromyces，菌株1K004與Talaromyces albobiverticilliusMH869906具有99%的自展值，較高的相似性；菌株D004、Q026、D005、W041聚集為一支歸屬于Aspergillus，該四株菌種為Aspergillus的可信度較高，菌株G038與Aspergillus restrictusJF922028的自展值達到99%；菌株2Y019、K009、K006、Y014、T018等聚集為一支，歸屬于Penicillium，其中菌株G033與Penicillium citrinumMH665234的自展值為99%。

2.4 豆腐乳中真菌相似性及多樣性分析

2.4.1 上饒地區豆腐乳中真菌菌群組成的多樣性從Shannon-Wiener指數（H）來看（圖2），鉛山縣石塘周邊（H=1.92）>廣豐區小康城安利小區（H=1.57）>婺源縣溪頭鄉呈川村（H=1.56）>玉山縣樟村鎮（H=1.50）>廣豐區洋口鎮（H=1.42）>鉛山縣紫溪鄉文山村（H=1.28）>上饒縣田墩鎮（H=1.26）>德興市紅山生活區（H=0.74），可以看出鉛山縣石塘周邊的豆腐乳中的真菌多樣性較高，而德興市紅山生活區的豆腐乳中的真菌多樣性是八個地區中最低的，該地區的豆腐乳中的真菌種類相當于其他七個地區更單調。

圖 1 基于LSU基因序列構建的豆腐乳菌株的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of soybean curd strain based on LSU gene sequence

圖 2 不同地區豆腐乳真菌的多樣性指數Fig.2 Diversity index of fermented soybean curd fungi in different regions

2.4.2 上饒地區豆腐乳中真菌菌群組成的相似性從相似性系數來看（表3），鉛山縣石塘周邊和廣豐區小康城安利小區豆腐乳的真菌的相似性系數（Cj）為1.00，而鉛山縣紫溪鄉文山村和玉山縣樟村鎮中豆腐乳的真菌的相似性系數（Cj）為0.29，并且Fungal只出現在鉛山縣紫溪鄉文山村、Trematosphaeria只出現在婺源縣溪頭鄉呈川村、Meyerozyma只出現在德興市紅山生活區，說明鉛山縣紫溪鄉文山村與玉山縣樟樹村鎮的豆腐乳中的真菌相似性不高，具有一定的差異性，鉛山縣石塘周邊和廣豐小康城安利小區的豆腐乳中的真菌的屬相似度很高，并且以上一些菌株只在個別地區存在，因此八個地區豆腐乳中的真菌類群存在一定的差異性和專一性。

3 結論

本研究從上饒市中八個地區豆腐乳中共分離了227個菌株，鑒定出26個分類單元：Penicillium、Aspergillus、Talaromyces、Fusarium等9個 屬26種。研究發現不同地區豆腐乳中的真菌種群數量和群落結構存在較大差異性與專一性，個別地區具有特殊的菌株，如婺源縣溪頭鄉呈川村豆腐乳中的真菌（Aspergillus novoparasiticus、Trematosphaeria biappendiculate）為該地區的特有菌株，Fungalsp.為鉛山縣紫溪鄉文山村豆腐乳中的特有菌株，Penicillium oxalicum、Penicillium mariae-crucis、Penicilliumsp.、Talaromyces aculeatus為玉山縣樟村鎮豆腐乳中的特有菌株。八個地區豆腐乳中分離得到的菌株多樣性系數和相似性系數結果表明，鉛山縣石塘周邊的豆腐乳真菌多樣性系數（H=1.92）最高，該地環境中能侵入豆腐乳的真菌相當于其他地區種類更多；而德興市紅山生活區的豆腐乳真菌為多樣性系數（H=0.74），是八個地區中最低，該地豆腐乳中的真菌比其他七個地區種類更少；由相似性系數分析可知，鉛山縣石塘周邊和廣豐區小康城安利小區豆腐乳的真菌的相似性系數（Cj）為1.00，而鉛山縣紫溪鄉文山村和玉山縣樟村鎮中豆腐乳的真菌的相似性系數（Cj）為0.29，不同兩個地區的菌株相似性系數不相同，說明不同地區自然發酵豆腐乳的真菌具有一定的差異性。影響八個地區豆腐乳中真菌多樣性的因素很多，如溫度、濕度、季節、覆蓋的稻草環境因素等[29?30]，而有關影響豆腐乳中真菌多樣性的具體機制有待進一步探究。

表 3 不同地區豆腐乳真菌的相似性指數Table 3 Similarity index of soybean curd fungi in different regions