超聲處理對羊乳中大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺滅效果

任 榮，張安琪，張富新，劉玉芳，王維哲，賀 超，劉瑩瑩，王畢妮

（陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西西安 710119）

乳中富含碳水化合物、脂肪、蛋白質、維生素、礦物質等多種營養成分，在人類膳食中，乳是所含營養成分最全、最適宜人消化吸收的全價營養食品，因此，人們還將乳汁稱為“完全食物”[1?3]。羊乳營養豐富，具有風味獨特、功能突出、易消化吸收等特點，被譽為“乳中之王”，在全球范圍內都具有一定的市場規模[4?5]。然而，新鮮羊乳生產加工過程中，由于擠奶方式、冷藏不及時、器具清洗殺菌不徹底等因素不可避免地引起微生物污染，其中包括大量致病菌[6]，如大腸桿菌O157:H7（Escherichia coliO157:H7）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）、停乳鏈球菌（Streptococcus dysgalactiae）和乳房鏈球菌（Streptococcus uberis）等，這些均嚴重影響羊乳的品質，并對消費者的健康造成一定威脅。因此為保證羊乳及其制品的安全性及貨架期的穩定性，促進羊乳產業的健康快速發展，羊乳中致病菌的殺滅至關重要[7?8]。

羊乳的傳統殺菌方式主要以熱處理為主，雖然殺菌效果明顯，但會破壞羊乳的營養品質，風味損失嚴重，降低其穩定性[9?10]。超聲殺菌技術是利用超聲波產生的空化效應、機械效應和熱效應等，能夠使微生物減少或滅活，同時對產品品質無負面影響，被認為是一種很有前景的傳統熱殺菌替代技術[11]。因此，采用超聲處理羊乳，有利于保證羊乳產品微生物安全、提高羊乳品質，對于研究開發高品質長貨架期的非熱殺菌羊乳具有重要意義。超聲處理已用于果蔬汁[12]、奶酪[13]、牛奶[14]、酸奶[15]等的生產，然而有關超聲處理對新鮮羊乳中的兩種常見條件致病菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌效果方面的研究鮮有報道。本研究采用超聲殺菌技術對新鮮羊乳進行殺菌處理，以期獲得超聲處理的最佳工藝條件，可以在保證殺菌效果的同時最大限度地保留羊乳原有的品質，為超聲殺菌技術在羊乳生產加工的應用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊乳 西安市長安區周邊牧場；金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003、大腸埃希氏菌BNCC133264購于西安晶博生物科技有限公司；戊二醛、磷酸鹽緩沖液（PBS）、營養肉湯培養基、平板計數培養基、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）、煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）、Baird-Parker瓊脂平板、腦心浸出液肉湯、兔血漿、營養瓊脂小斜面、亞碲酸鉀卵黃增菌液 北京奧博星生物技術有限責任公司。

SCIENTZ-950E超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；CU600A恒溫水槽

上海福瑪實驗設備有限公司；GHP-9270隔水式恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；S-3400N掃描電子顯微鏡 日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液及污染羊乳的制備 根據金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003與大腸埃希氏菌BNCC133264菌種附帶的指導書分別將兩種菌進行活化復壯，吸取200 μL上述菌液加入100 mL營養肉湯培養基中，37 ℃培養24 h，再經過4500 r/min離心15 min，棄去上清液，菌體沉淀用PBS清洗兩次后，采用比濁法[16]將金黃色葡萄球菌與大腸埃希氏菌混合菌液濃度調整為108CFU/mL，再按照1%（V/V）比例接種至原乳中，制成待測污染羊乳。

1.2.2 巴氏殺菌處理 取100 mL待測污染羊乳置于250 mL錐形瓶中，封口膜封住瓶口，巴氏殺菌條件為65 ℃水浴處理30 min，處理后迅速冷卻至3~5 ℃，4 ℃冰箱保存備用。

1.2.3 超聲殺菌處理 將與恒溫水槽連接的夾套燒杯用75%酒精浸泡30 min，然后用無菌去離子水沖洗3遍，再用羊乳潤洗1次，取100 mL污染羊乳加至夾套燒杯，開啟水浴循環使羊乳預熱到設定溫度，啟動超聲（超聲頻率為20~25 kHz），在不同功率、溫度、時間下進行超聲處理。超聲過程中全程開啟水浴循環，以保持恒定溫度，超聲停止后立即取樣，立即測定大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的菌落總數，大腸桿菌計數培養方法參考國家標準GB 4789.3-2016中的第二法，金黃色葡萄球菌計數培養方法參考國家標準GB 4789.10-2016中的第二法[17?18]，以僅預熱未超聲處理的污染羊乳作為對照，計算滅菌對數值Nk，每份樣品重復測定3次。

式中：Nk，滅菌對數值；N，經滅菌處理后的條件致病菌菌落總數，CFU/mL；N0，對照組中的條件致病菌菌落總數，CFU/mL。

1.2.4 單因素實驗設計 以滅菌對數值（Nk）為評價指標，研究超聲功率、超聲溫度以及超聲時間對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的滅菌效果，條件設置如下：恒定超聲溫度為50 ℃，超聲時間為15 min，改變超聲功率（0、100、200、300、400、500、600 W）；恒定超聲功率為400 W，時間為15 min，設定不同的超聲溫度（20、30、40、45、50、60 ℃）；恒定超聲功率為400 W，溫度為50 ℃，設定不同的超聲時間（0、10、15、20、25、30 min）。

1.2.5 響應面試驗設計 在單因素實驗結果的基礎上，采用Box-Behnken模型，以超聲功率（A）、超聲溫度（B）和超聲時間（C）為自變量，以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的滅菌對數值（Nk）為響應值，進行三因素三水平響應面試驗，試驗設計如表1。

表 1 Box-Behnken響應面設計試驗因子與水平Table 1 Variables and levels in response surface design

1.2.6 菌落形態掃描電鏡（SEM）觀察 參考胡春輝等[19]的方法制備對照組、巴氏殺菌組和超聲處理組的掃描電鏡樣品，采用S-3400N掃描電子顯微鏡對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細胞菌體形態進行觀察，其中超聲處理組樣品的制備條件為上述響應面分析所得的最佳條件。

1.2.7 不同處理下羊乳貯藏期微生物數量變化 將對照組（污染羊乳）、超聲組（超聲殺菌污染羊乳）和巴氏組（巴氏殺菌污染羊乳）分別置于4 ℃下貯存，并在0、1、7、14、17、21 d時取樣對其中的菌落總數，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進行計數，菌落總數計數培養方法參考國家標準GB 4789.2-2016[20]，每組處理重復測定3次。

1.3 數據處理

顯著性分析采用DPS 8.0軟件進行one-way ANOVA分析，結果以三次平行實驗結果的平均值±標準差表示，置信水平為0.05；采用Origin 2018軟件進行相關圖表的繪制；利用Design Expert 8.0.6軟件進行響應面設計與分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

在超聲溫度為50 ℃，超聲時間為15 min時，不同超聲功率對污染羊乳中大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的Nk值的影響如圖1A。超聲功率低于400 W時，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌之間的殺滅效果無顯著性差異，其中100~200 W內，兩種菌株的Nk值持續增大，200~400 W內，Nk值變化相對緩慢。當超聲功率由400 W增加至500 W，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的Nk值分別增加了38.6%、13.1%，當超聲功率由500 W增至600 W時，兩種菌株的Nk值漲幅開始降低，為避免聲強過高產生聲屏障減弱殺菌效果，因此選擇超聲功率500 W為中心試驗點。此外，超聲功率超過400 W后，大腸桿菌殺菌效果優于金黃色葡萄球菌，說明大腸桿菌對超聲處理更為敏感。

在超聲功率為400 W，超聲時間為15 min時，不同超聲溫度對污染羊乳中的兩種條件致病菌Nk值的影響如圖1B。超聲溫度在低于40 ℃時，兩種條件致病菌殺菌效果不明顯，當超聲溫度再上升5 ℃時（45 ℃），兩種條件致病菌的滅菌對數值迅速上升，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的Nk值分別增大了約15和40倍。可見超聲溫度對這兩種致病菌的殺菌效果影響顯著，這與林祎等[21]的研究結果一致。此外，當超聲溫度為50 ℃時，兩種條件致病菌的滅菌對數值持續增加，而在50~60 ℃時，滅菌對數值增加趨勢放緩，且溫度持續升高會對羊乳中的風味成分、活性分子、營養物質造成損失[22?23]。因此在后續響應面試驗設計中，選擇50 ℃為中心試驗點進行后續試驗。

圖 1 不同超聲功率、溫度和時間對新鮮羊乳中大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的滅菌效果影響Fig.1 Effects of different ultrasonic power, temperature, and time on inactivation of E. coli and S. aureus in fresh goat milk

在超聲功率為400 W，超聲溫度為50 ℃時，不同超聲時間對污染羊乳中的兩種條件致病菌Nk值的影響如圖1C所示。隨著超聲時間延長，Nk值持續增大，表明超聲處理時間對兩種條件致病菌有一定的殺菌效果，而在超聲處理30 min時Nk值仍然呈上升趨勢，這可能是由于超聲過程中會產生熱效應，盡管在試驗中已經循環通入冰水控制溫度，但熱效應與空化效應的協同作用仍然存在，此外，在試驗設計時為確保Nk值結果可計算，細菌初始添加量和濃度較高，這也會一定程度地造成Nk持續增大。從超聲效率方面考慮，降低超聲時間過長造成的熱效應，最大程度地保留羊乳中營養物質，提高生物利用率，因此選擇超聲時間20 min為中心試驗點。

2.2 響應面試驗設計與結果

2.2.1 響應面回歸模型的建立與分析 本實驗響應面試驗設計與結果見表2，利用Design Expert8.0.6軟件對表2中的數據進行多元回歸擬合分析，得出大腸桿菌的滅菌對數值（y1）和金黃色葡萄球菌的滅菌對數值（y2）的二次回歸模型，分別見公式（2）、（3）。

大腸桿菌和金黃色葡萄球菌兩個指標的ANOVA方差分析如表3所示，兩個回歸模型均具有高度的顯著性（P<0.0001），失擬項均不顯著（P>0.05），說明兩模型擬合程度良好，所得回歸方程較為可靠，可以用來分析和預測超聲處理對羊乳中大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的滅活效果。

各因素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的Nk值影響程度的大小依次是B>C>A，其中超聲溫度B、時間C及B2對大腸桿菌Nk值的影響達到極顯著水平（P<0.0001），A和C2達到較顯著水平（P<0.01），A2及交互作用項AC、BC的影響顯著（P<0.05）；溫度B、時間C對金黃色葡萄球菌Nk值影響極顯著（P<0.0001），B2影響較顯著（P<0.01），A和C2影響顯著（P<0.05）。

2.2.2 兩因子間交互作用分析 圖2為分析各因素間交互作用的響應面圖，是由響應值與各試驗因子構成的立體曲面圖，顯示的是當超聲功率、溫度和時間三因素任意一個取0水平時，其它兩個因素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌響應值Nk的影響。等高線的形狀可以反映因素間交互作用的顯著性，等高線形狀為圓形表明因素間交互作用不顯著，為橢圓形則表明因素間交互作用顯著[24]。

表 2 響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface experiment

表 3 多元方程方差分析表Table 3 ANOVA for the quadratic equation

圖2 所示分別為大腸桿菌和金黃色葡萄球菌各因素間具有顯著交互作用的響應面圖，是由響應值與各試驗因子構成的立體曲面圖，顯示的是當超聲功率、溫度和時間三因素兩兩交互作用于響應值Nk的影響。超聲時間對大腸桿菌的影響較大，且AC、BC的交互作用顯著（P<0.05）。此外，溫度的曲面坡度比功率的曲面坡度更陡峭，與方差分析中超聲處理溫度對大腸桿菌Nk值的影響大于超聲功率的結果一致（圖2B、2C）。而金黃色葡萄球菌Nk值的溫度-時間等高線圖較為密集，BC之間的交互作用顯著（P<0.05），此結果與方差分析結果一致。

2.2.3 最佳條件的預測及驗證試驗 美國FDA推薦的致病菌滅菌對數值為≥ 5[25]，因此，在超聲功率、超聲溫度和超聲時間盡可能小的情況下，保證大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的Nk值均大于5。通過軟件運算所得的最優殺菌條件為：超聲功率528.58 W、溫度為59.64 °C、時間為29.64 min，考慮到實際操作，將最佳殺菌條件調整為：530 W、60 °C、30 min，并對此殺菌條件進行試驗驗證，得到該條件下的實測值為：大腸桿菌Nk值為7.55，金黃色葡萄球菌Nk值為6.53。與預測值（7.78、6.77）相比，誤差均在5%以下，說明此優化條件下模型預測值與實際值高度擬合，證實該模型可以用來預測與分析超聲處理對羊乳中大腸菌群和金黃色葡萄球菌的滅菌效果。

2.3 不同殺菌處理對菌體細胞表面形態的影響

未經處理的大腸桿菌表觀形態如圖3A所示，菌體細胞呈長桿狀，形態圓潤飽滿。菌懸液經巴氏殺菌處理后（見圖3B）表面出現皺縮現象，菌體細胞不再呈長桿狀，出現嚴重內凹，部分菌體破裂，細胞內容物泄露。菌懸液經超聲處理后（見圖3C），出現大量的細胞碎片，菌體被嚴重破壞，內容物完全外泄，部分保留有完整細胞膜形狀的菌體也已成為空殼，呈干癟凹陷狀。與巴氏殺菌處理相比，超聲處理對大腸桿菌細胞表面形態影響更大，對菌體細胞的破壞性更強。超聲處理時，由于其局部區域所受壓力周期性改變可能導致共振，引起其雙層磷脂分子振動頻率和振幅加大，細胞膜穿孔甚至破裂，使胞內胞質流出，加速菌體死亡[26]。

未經處理的金黃色葡萄球菌表觀形態如圖4A所示，菌體細胞為圓形，排列呈葡萄球狀，形態圓潤飽滿。菌懸液經巴氏殺菌處理后（圖4B）菌體表面無明顯裂痕，細胞內容物也無明顯泄露，大部分菌體細胞開始出現還能聚集在一起。菌懸液經超聲處理后（圖4C)菌體開始出現部分皺縮，但基本維持原來的形狀，細菌呈明顯分散狀態，不再保持葡萄球狀。可

見超聲處理對金黃色葡萄球菌的細胞表面結構影響最大，對菌體細胞膜的損傷最為嚴重，可能與細胞壁成分和結構的差異有關：大腸桿菌為革蘭氏陰性桿菌，其細胞壁外膜和細胞膜均容易被撕裂而產生孔洞，導致胞內胞質流出，加速細胞死亡；而金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，細胞壁較厚，為一層鉸鏈立體網狀的肽聚糖層，其剛性較強，且有磷壁酸分子對肽聚糖層進行加固，對細胞膜起到保護作用，因此其結構保持較為完整，死亡率較低。這與文獻[27]報道的結果一致。

在4 °C下貯藏的對照組、超聲組和巴氏組，其微生物指標的變化如表4所示。對照組原乳的初始菌落總數（TPC）、大腸桿菌菌落數（TCC）和金黃色葡萄球菌菌落數（S.aureus）已經超出了國家標準，貯藏過程中各菌落數均不斷增加，第7 d時菌落總數、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌落數分別已達8.64、7.44和6.64 lg CFU/mL，遠超國家標準，在后續的貯藏時間點就未再檢測對照組的微生物指標。

與對照組原乳相比，巴氏殺菌對新鮮羊乳中菌落總數的殺菌率為46.41%，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌率達到100%，各微生物指標符合國家標準。在4 °C貯藏14 d后，羊乳中微生物不斷增殖，菌落總數增長了46.5%，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌初次被檢出，菌落數分別達到2.56和0.67 lg CFU/mL，已超出國家標準，這可能是由于巴氏殺菌處理對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細胞影響相對溫和，雖然菌體細胞出現皺縮，粘連現象，但能保持基本形態，在羊乳中未失去增殖活性，在貯藏過程中再次被檢出（圖3B和4B）。巴殺乳貯藏21 d后，各微生物指標均明顯增加，菌落總數、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌落數分別達到5.97、3.47和2.20 lg CFU/mL。

從表4可以看出，超聲處理對新鮮羊乳中菌落總數的殺菌率為85.63%，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌率達到100%，各微生物指標均在國家標準要求范圍內。在4 °C貯藏21 d后，超聲乳的菌落總數為2.7 lg CFU/mL，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在貯藏期內均未被檢出，仍符合國家標準。與巴殺乳相比，超聲乳的殺菌效果更好，這可能與兩種處理方式的滅菌機制不同有關。

3 討論

目前超聲處理在乳中的研究和應用主要是針對牛乳、奶酪等[28?29]，對新鮮羊乳的殺菌處理尚未見應用，同時超聲處理對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的菌懸液的殺菌效果已有所研究，但尚未研究超聲處理對羊乳中的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌效果。由于羊乳中所含的脂肪等物質可能對致病菌產生一定的保護作用[30]，因此研究超聲處理對新鮮羊乳中大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌效果影響是很有必要的。本研究表明，超聲處理對新鮮羊乳中大腸桿菌的殺菌效果要強于金黃色葡萄球菌，這可能與大腸桿菌是革蘭氏陰性菌，而金黃色葡萄球菌是革蘭氏陽性菌有關。超聲處理牛奶的參數為400 W，63 ℃，30 min，可使牛奶在4 ℃下保存16 d以上[31]，聲熱復合處理液態奶（復原乳）的殺菌參數為400 W，50 ℃，10 min，貨架期為10 d左右，比巴殺乳多3 d左右[32]。本研究確定的超聲處理新鮮羊乳的工藝參數為：超聲功率530 W，超聲溫度60 ℃，超聲時間30 min，可延長貨架期至21 d左右，明顯優于其他乳及乳產品的處理工藝，可能是由于不同的乳產品具有不同的成分含量和組成，且超聲處理方式和條件均存在一定差異。

表 4 不同殺菌處理對羊乳貯藏過程中微生物指標的影響（lg CFU/mL）Table 4 Effects of different sterilization treatments on the microbial indexes of goat milk during storage (lg CFU/mL)

超聲處理主要是通過產生機械剪切力以及局部的高溫和壓力，也會在液體介質中產生分子震動從而產生破壞性的物理效應[11]，在食品加工過程中，超聲處理有著微生物滅活、均質、脫氣和重金屬去除等多重作用[33?34]。盡管超聲殺菌處理能夠使羊乳滿足商業無菌要求，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌效果也較理想，但單純的超聲處理難以達到滿意的效果，必須要使樣品控制在一定溫度范圍內。在預試驗期間，研究發現熱處理和超聲處理聯合殺菌，可以有效地縮短超聲殺菌時間，并提高其殺菌效果。因此，在后續的研究過程中，可以縮短殺菌時間為生長點，最大化發揮超聲本身的空化效應和熱效應的聯用效果，研究超聲短時或瞬時殺菌的應用效果，保留羊乳中的生物活性物質，減少營養價值的損失。

4 結論

超聲殺菌作為一種新型非熱殺菌方式對新鮮羊乳具有較好的殺菌效果。本研究通過單因素實驗和響應面優化分析確定了超聲處理的最佳工藝條件為：超聲功率530 W，超聲溫度60 ℃，超聲時間30 min，在此條件下處理的羊乳在4 ℃下貯藏21 d后仍保持較低的菌落數，明顯優于巴氏殺菌羊乳。因此超聲處理可用于生產高品質長貨架期的羊乳產品，可為羊乳的殺菌處理提供新的加工技術。