產ACE抑制肽菌株的篩選及其在模擬消化道環境中的活性分析

邵伯悅，馬春麗，余鵬飛，王家栩，賈麗麗

（東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱 150030）

我國高血壓患者的人數持續走高，2019年約有2.45億高血壓患者，且患者越來越年輕化[1]，由于高血壓是引起心腦血管疾病和中風的危險因素[2]，因此很多學者就高血壓問題進行了長期且深入的研究。腎素-血管緊張素-醛固酮系統參與調節血壓的一部分，主要是由血管緊張素轉換酶（ACE）將血管緊張素I轉化為血管緊張素II，是系統的主要組成部分之一[3]；此外，緩激肽也會被ACE所降解，從而達到舒張血管的作用。因此，通過抑制ACE活性并防止血管緊張素轉化為有效形式化合物的方法，可以減輕高血壓癥狀[4]。盡管降壓藥在調節血壓中起著基本作用，但它們通常會出現多種副作用，因此，許多研究人員在食品中尋求諸如生物肽之類的ACE抑制物質，以使此類肽可用于高血壓的預防和治療[5?6]。

ACE抑制肽是蛋白質水解生成的一種小分子肽，通過抑制ACE活性，讓血管緊張素不能轉化，從而達到緩解高血壓的作用[7]。有研究報道，一些乳酸菌Lb. helveticus、Lb. delbrueckiisubsp.bulgaricus、Lc. lactissubsp.cremoris、Lc. lactissubsp.lactisbiovar.diacetylactis在發酵過程中通過水解牛奶中的蛋白可以釋放ACE抑制肽[8?9]，且已有幾種ACE抑制肽在發酵乳[10]和干酪[11]中被鑒定出來，此外，通過模擬計算的方法還探究ACE抑制肽的作用機制[12?13]。Solanki等[14]用Lb. rhamnosusMTCC 5945制備發酵駝奶，分析其ACE抑制活性，并分離鑒定了新的ACE抑制肽。

本試驗目的是從27株乳酸菌中，篩選出一株發酵牛乳富產ACE抑制肽且具有益生菌潛力的菌株，為抗高血壓發酵乳的研發提供科學的數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗室保存的27株乳酸菌 11株菌C2、C5~C13、Q6分離自干酪，13株菌M1~M13分離自生牛乳，另外3種為雙歧桿菌（Bifidobacterium）、鼠李糖乳桿菌（Lb. rhamnosus）、植物乳桿菌（Lb. plantarum）；MRS液體培養基 青島海博生物；脫脂乳粉 紐仕蘭新云電子商務有限公司；馬尿酰-組胺酰-亮氨酸（HHL）、ACE（來自兔肺，酶活0.1 UN） 上海源葉；胃蛋白酶（1:3000）、胰蛋白酶（1:250） 大連美侖生物技術公司；鄰苯二甲醛 Biotopped公司；乙酸乙酯 天津市富宇精細化工有限公司；其他試劑 均為國產分析純。

GL-21M高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗儀器開發有限公司；T6新世紀紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；數顯攪拌水浴鍋 常州賽普實驗儀器廠；雷磁PHS-3C pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 產ACE抑制肽乳酸菌的初篩

1.2.1 發酵乳制備 從?80 ℃冰箱中取出保藏的27株乳酸菌，在MRS液體培養基中37 ℃活化12 h，將活化的菌株，按照2%（v/v）的接種量接種到滅菌復原脫脂乳（10%，w/v）中，37 ℃培養至乳凝固后，轉移至4 ℃冰箱，以停止進一步酸化。取樣測定pH、滴定酸度、蛋白水解活力和ACE抑制率。

1.2.2 pH測定 將凝固的發酵乳漩渦震蕩后取5 mL進行pH測定。

1.2.3 滴定酸度的測定 酸度值以吉爾涅爾度（°T）表示，方法參照GB 5009.239-2016。

1.2.4 蛋白水解活性測定 采用OPA法對蛋白水解度進行測定[15]。以亮氨酸為標準溶液，樣品的蛋白水解活力以μg/mL亮氨酸為單位。

取2.5 g樣品，加入1 mL去離子水，5 mL 1.0%的三氯乙酸，振蕩混勻后靜置，3000×g離心5 min，取0.4 mL上清液與3 mL OPA溶液混勻后靜置2 min，在340 nm測吸光值。

1.2.5 發酵乳ACE抑制活性的測定 發酵乳清的制備：測定樣品pH，將pH調至4.6后，5000 r/min離心15 min，保留上清液，再將pH調節至8.3后，5000 r/min離心15 min，保留上清液。

方法參照Cushman等[16]、張秋紅[17]并略作修改。取5 mL離心管，加入5 mmol/L HHL底物為0.05 mol/L的硼酸鈉緩沖液200 μL，再加入100 μL待測乳清，混合，在37 ℃水浴中預熱3 min，加入20 μL ACE酶液，在37 ℃水浴中等待30 min，再加入250 μL 1 mol/L鹽酸終止反應。加入1.7 mL乙酸乙酯，振蕩15 s，4000 r/min離心10 min，取上層的1 mL乙酸乙酯，加熱揮發去除有機溶劑，再加入3 mL去離子水，并振蕩搖勻，用紫外分光光度計在228 nm測定樣品吸光值。按照以下公式計算ACE抑制率：

式中，A為樣品組吸光度值；B為對照組吸光度值；C為空白組吸光度值。

1.2.6 體外模擬人工胃腸消化 人工胃液、腸液參照藥典[18]進行配制。參照陳儀婷等[19]方法并略作修改。取樣品5 mL，測定其乳清樣品的ACE抑制率；將剩余發酵乳以10%添加到人工胃液中，然后37 ℃水浴消化3 h，沸水浴加熱10 min以終止反應，取樣測定其ACE抑制率；再將其以10%添加到人工腸液中，然后37 ℃水浴消化3 h，沸水浴加熱10 min以終止反應，再取樣測定其ACE抑制率。

1.3 產ACE抑制肽乳酸菌的復篩

1.3.1 菌株的酸耐受性試驗 參照黃燕燕等[20]方法并略作修改。將MRS培養基的pH分別調整為3.0、4.0、5.0，pH為6.0的MRS培養基為對照組，分裝至各試管。以2%接種量分別接種至上述MRS培養基中，37 ℃培養3 h后取菌液，進行菌落計數，計算酸耐受性，即：

其中：Nt、N0分別為試驗組樣品和對照組樣品中的活菌數（CFU mL?1）。

1.3.2 菌株的膽鹽耐受性試驗 參照陳大衛等[21]方法并略作修改。將乳酸菌以2%量接種于含有0.3%膽鹽的MRS液體培養基中，于37 ℃培養3 h，以不加膽鹽的MRS肉湯培養基為對照組，進行菌落計數。按下列公式計算菌株的膽鹽耐受性：

其中：Nt、N0分別為試驗組樣品和對照組樣品中的活菌數（CFU mL?1）。

1.3.3 菌株的鹽耐受性試驗 參照孫杰等[22]方法并略作修改。將乳酸菌以2%量接種于含NaCl質量濃度為4 g/100 mL的MRS培養基中，37 ℃培養24 h后取菌液，進行菌落計數，以不加NaCl的MRS培養基中的菌落數為對照，計算鹽耐受性，即：

其中：Nt、N0分別為試驗組樣品和對照組樣品中的活菌數（CFU·mL?1）。

1.4 菌株16S rDNA鑒定

將篩選的菌株送至吉林省庫美生物科技有限公司進行16S rDNA鑒定，并將鑒定結果經RDP數據庫[23?24]比對后，使用MEGA 7.0軟件[25]進行系統發育樹的構建。

1.5 數據處理

采用SPSS22.0統計軟件進行統計學分析，數據均采用X ±SD表示，并采用方差分析，相關性比較模塊，采用Origin8.0進行作圖，每個試驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 產ACE抑制肽乳酸菌的初篩

對實驗室保藏的27株乳酸菌進行發酵實驗，測定pH、滴定酸度、蛋白水解活力及ACE抑制率，所得結果見表1。

表 1 發酵乳pH、滴定酸度、蛋白水解活力、ACE抑制活性結果Table 1 Results of fermented milk pH, titration acidity, protein hydrolysis activity, and ACE inhibition activity

結果顯示，不同菌株間的這些性能存在很大差異，由不同乳酸菌發酵酸乳的ACE抑制活性在60%以上的有6株，它們是M11、M3、M10、Bifidobacterium、M12、M6，抑制活性最高的是菌株M11，抑制率為76.84%±1.98%，其次是M3，抑制率為71.94%±1.39%。ACE抑制率小于30%的有11株乳酸菌，最低的只有3.79%±1.79%。樣品的pH在4.40~5.10之間，滴定酸度在45~85 °T之間，菌株M10、M5、M11、M2、M6、M3、C7具有相對較高的產酸性能。蛋白水解活性在100 μg/mL亮氨酸以上的菌株有6株，它們是C11、M10、C7、M9、M12、M13。

乳酸菌發酵脫脂乳的ACE抑制活性作為篩選菌株的直接指標，篩選出發酵乳ACE抑制活性在60%以上的菌株6株。乳酸菌M11、M3、M10、M12和M6的蛋白水解能力都在80 μg/mL亮氨酸以上，具有相對較高的蛋白水解能力；乳酸菌M11、M3、M10和M6的滴定酸度都在70 °T以上，具有較好的產酸能力，因此選擇M3、M6、M10和M11進行接下來的試驗。

2.2 乳酸菌在模擬胃腸液中ACE抑制活性的變化

如圖1所示，不同乳酸菌的發酵乳經人工胃液和腸液作用后，所得ACE抑制活性變化有很大差異。菌株M3在胃液和腸液作用后，ACE抑制活性先升高后降低，但仍顯著高于消化前（P<0.05），為74.96%±1.73%，且顯著高于其他菌株（P<0.05）；M6、M10、M11在胃液和腸液作用后均逐漸降低，分別為49.21%±2.20%、58.80%±3.67%、62.66%±2.68%。菌株M3先上升的原因可能是因為在胃蛋白酶的作用下，一些大的氨基酸殘基被水解成小分子的多肽，使得ACE抑制肽的濃度變大，抑制活性增強；而在胰蛋白酶的作用下，一些小分子多肽被進一步分解成無活性的游離氨基酸或者是氨基酸殘基，使得ACE抑制活性下降。對于另外3株乳酸菌，在胃蛋白酶及胰蛋白酶作用下ACE抑制活性逐漸下降，可能是因為原有的具有ACE抑制活性的肽被分解，無活性的肽或者游離氨基酸比例增大造成的[26?27]。

圖 1 人工模擬胃液腸液對ACE抑制活性的影響Fig.1 Effect of artificial simulated gastric and intestinal fluids on ACE inhibitory activity

2.3 菌株酸耐受性

益生菌在人體中發揮益生菌功能的前提是能夠順利通過胃酸構成的生物屏障，穩定粘附于腸上皮細胞，實現定植[28]。食物在胃中存留的時間大約為1~3 h[29]，因此選擇3 h作為耐受時間。在食用乳制品后，胃液的pH一般在3左右[30]，因此，能夠在胃腸道中發揮作用的乳酸菌必須對酸有很強的耐受性。試驗菌株酸耐受性結果如圖2所示，在pH為3.0~5.0的范圍內，隨著酸度的增加，菌株的酸耐受性在逐漸下降，在pH3時，菌株的酸耐受性降至10%~30%，菌落數大約為7 lg CFU mL?1，依然滿足益生菌的推薦攝入量大于6 lg CFU mL?1劑量[30]。因此，菌株M3、M6、M10、M11均能耐受胃酸環境且保持一定的活菌數。

圖 2 菌株的酸耐受性Fig.2 Acid tolerance of the strains

圖 3 菌株系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strains

2.4 菌株膽鹽耐受性

人體小腸內的膽鹽含量約為0.3%，食物通過一般需要1~4 h。因此，乳酸菌應具有一定的膽鹽抗性，并在經過小腸時仍能維持活力，發揮益生菌作用[31]。試驗菌株的膽鹽耐受性如表2所示，菌株M3經0.3%膽鹽作用3 h后，膽鹽的耐受性為37.50%±2.47%，顯著高于其他菌株（P<0.05），M10最低為24.09%±0.31%。根據菌落計數的結果，經0.3%膽鹽作用3 h后，4株試驗菌株活菌數均高于益生菌推薦攝入量。因此，4株乳酸菌均具有膽鹽耐受性。

表 2 菌株的膽鹽耐受性Table 2 Bile salt tolerance of the strains

2.5 菌株鹽耐受性

乳酸菌的耐鹽性也是評價乳酸菌品質的一個重要指標。NaCl在人體內的質量濃度為1~4 g/mL[32]。高鹽會導致高滲透壓，細胞失水造成胞質分離[33]。表3所示為試驗菌株的鹽耐受性結果，添加4% NaCl后，菌株的耐鹽性大約在20%~40%，其中M3的鹽耐受性是最高的，為37.32%±1.84%，說明高鹽抑制了菌株的存活率，而乳酸菌有一定的鹽耐受性，使得菌落計數的結果在7 lg CFU mL?1以上，依然滿足推薦益生菌攝入的最低攝入量。因此，四株乳酸菌均具有一定的鹽耐受性，其中M3的鹽耐受性更強。

表 3 菌株的鹽耐受性Table 3 Salt tolerance of the strains

2.6 菌株16S rDNA鑒定

經篩選后發現，菌株M3的ACE抑制活性為71.94%±1.39%，能耐受人工胃腸液環境，且該菌具有較好的產酸性能和蛋白水解活性，能耐受模擬消化環境，保持活菌數量。送樣測定M3菌株的16S rDNA序列，并經RDP數據庫比對并構建系統發育樹（圖3）后發現，M3菌株與Lactobacillus paracaseisubsp.paracasei的同源性在99%以上，因此乳酸菌菌株M3是Lb. paracaseisubsp.paracasei。

3 結論

本研究顯示，試驗菌株間的ACE抑制活性存在較大差異，經初篩獲得菌株M3、M6、M10和M11有較高的ACE抑制活性，同時具有較好的產酸或蛋白水解性能，經模擬胃腸消化后，菌株M3的ACE抑制活性呈現先上升后下降的趨勢并保持較高活性，另外3株乳酸菌的ACE抑制活性都呈現逐漸下降的趨勢。在環境耐受性的試驗中，4株乳酸菌都呈現出對酸、膽鹽、鹽的良好耐受性，菌落計數結果顯示，都能滿足推薦益生菌攝入量的最低量（6 lg CFU mL?1），尤其是M3菌株，呈現出更高的環境耐受性。M3菌株經16S rDNA菌株鑒定為Lb. paracaseisubsp.paracasei。此外，該菌株如何抑制ACE活性以及在體內是否具有抗高血壓能力，還需要進一步研究。