黑木耳蛋白提取工藝優(yōu)化及其功能特性研究

安兆祥，蔡志鵬，黃占旺，沈勇根，徐 弦，程宏楨，李曉明，劉馥源

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西省發(fā)展與改革委員會(huì)農(nóng)產(chǎn)品加工與安全控制工程實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330045）

黑木耳（Auricularia auricula），又名樹雞、光木耳、木蕊等，木耳科木耳屬膠質(zhì)真菌，在我國(guó)主要栽培于黑龍江、四川、廣西和云南等地。黑木耳子實(shí)體膠質(zhì)含量較高，質(zhì)地柔軟平滑，味道鮮美[1]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，黑木耳具有潤(rùn)肺止咳、滋腎養(yǎng)胃、潤(rùn)燥、補(bǔ)氣養(yǎng)血等作用，黑木耳富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、多糖、維生素、膳食纖維和氨基酸等物質(zhì)，是我國(guó)珍貴的藥食兼用真菌[2]。黑木耳蛋白含量為10.0~16.2 g/100 g[3]，其蛋白質(zhì)中含有17種氨基酸，尤以谷氨酸和天門冬氨酸為主[4]。研究表明，黑木耳蛋白具有抗腫瘤[5]功效。

黑木耳因蛋白質(zhì)含量高、脂肪熱量低等特點(diǎn)，已成為獲取植物蛋白的新興資源[1]。依據(jù)黑木耳蛋白的凝膠特性，將其添加到半固體食品中，可以改善食品的機(jī)械性能；在液體食品中可以提高乳化液的穩(wěn)定性，還可以降低油-水界面的張力，提高該物質(zhì)的熱穩(wěn)定性，延長(zhǎng)其貨架期[4]。目前，提取植物蛋白常規(guī)的方法有酶法、超聲波法、堿法和復(fù)合法等[2]。左瑩等[6]采用酶法水解玉米淀粉糖渣蛋白，提取率為39.77%，酶法提取反應(yīng)條件溫和，能耗低，但提取率低，成本高；姚興存等[7]采用超聲波輔助提取條斑紫菜蛋白，提取率為37.6%，超聲波法耗能少、時(shí)間短，但對(duì)儀器設(shè)備要求高；李曉明等[8]采用堿法提取白玉菇蛋白，提取率為43.19%，堿法操作簡(jiǎn)單，成本低，但高堿條件易使蛋白變性。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外的研究成果表明，超聲輔助酶法的提取技術(shù)具有很大的研究前景[9?10]。超聲輔助酶法是近年來(lái)發(fā)展較快的新型提取方法，由于超聲波在溶液中迅速產(chǎn)生空化、剪切、劇烈攪拌等作用，同時(shí)結(jié)合酶高效、專一的特點(diǎn)，能夠降解植物細(xì)胞壁及組織，提高細(xì)胞壁和細(xì)胞膜通透性并加速蛋白的溶出[11]。許新月等[12]采用超聲輔助酶法提取杏鮑菇蛋白，提取率為75.7%；Hildebrand等[13]使用超聲波輔助溶菌酶提取小球藻蛋白，回收率從33%提高至42%，使用超聲波輔助蛋白酶提取可促進(jìn)蛋白質(zhì)的恢復(fù)率（58%~82%）。因此，相比于傳統(tǒng)的蛋白提取方法，超聲波-酶法具有省時(shí)、節(jié)能和高效等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于生物活性成分等的提取[14?15]。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于黑木耳蛋白的研究鮮有報(bào)道，主要集中在黑木耳碳水化合物的提取和功能性質(zhì)研究[16?17]，且運(yùn)用超聲波-酶法優(yōu)化黑木耳蛋白提取工藝的研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬研究超聲波-酶法提取黑木耳蛋白，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，結(jié)合Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)設(shè)計(jì)和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定黑木耳蛋白最適提取工藝，并在不同pH下對(duì)所得蛋白功能特性進(jìn)行測(cè)定，以期為黑木耳蛋白的提取利用與綜合開發(fā)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑木耳 市購(gòu)，產(chǎn)地黑龍江省；菜籽油 市購(gòu)，產(chǎn)地安徽蕪湖金龍魚工廠；無(wú)水乙醇 天津市大茂化學(xué)試劑廠；牛血清蛋白（BSA） 上海源葉生物科技有限公司；堿性蛋白酶（15萬(wàn)U/g，最適作用溫度65 ℃、pH8.5） 河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250上海強(qiáng)順化學(xué)試劑有限公司；硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、磷酸均為分析純。

K-355凱氏定氮儀 瑞士步琪有限公司；SB-3200DTD超聲波清洗儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；WFJ 2100可見分光光度計(jì) 尤尼科（上海）科學(xué)儀器有限公司；Q500B高速多功能粉碎機(jī) 上海冰都電器有限公司；SF-GL-20高速冷凍離心機(jī)上海菲恰爾分析儀器有限公司；T-25 basic高速分散機(jī) 艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；BSA124S電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；便攜式pH計(jì) 上海大普儀器有限公司；BYXX-50烘箱杭州艾博科技工程有限公司；Scientz-10N冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 挑選無(wú)霉?fàn)€蟲蛀、無(wú)機(jī)械損傷的黑木耳清洗除雜，于烘箱60 ℃烘干4 h，冷卻后粉碎，過(guò)100目篩，得到黑木耳粉，置于干燥環(huán)境下保存，備用。

1.2.2 黑木耳蛋白提取工藝流程 黑木耳粉→稱量→溶解→超聲處理→調(diào)pH→酶解→滅酶→離心分離→取上清液（蛋白提取液）→測(cè)蛋白含量→等電點(diǎn)沉淀→離心分離→沉淀水洗至中性→真空冷凍干燥→黑木耳蛋白。

1.2.3 操作要點(diǎn) 黑木耳按1.2.1方法預(yù)處理，稱取一定量的木耳粉末，按料液比1:80（g/mL）進(jìn)行溶解，然后在超聲功率180 W，50 ℃超聲30 min，之后用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)溶液pH為10.5，再添加5%的堿性蛋白酶，40 ℃水浴加熱酶解2 h，90 ℃滅酶15 min，10000 r/min離心15 min，收集上清液，得到蛋白提取液，用0.1 mol/L HCl溶液調(diào)pH至3.5，于4 ℃冰箱中冷沉24 h后，12000 r/min離心15 min，收集沉淀，水洗至中性，真空冷凍干燥，得黑木耳蛋白。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 在超聲波-酶法提取黑木耳蛋白工藝中，首先對(duì)木耳粉進(jìn)行超聲波預(yù)處理，處理結(jié)束后進(jìn)入酶解反應(yīng)，研究各參數(shù)對(duì)蛋白提取率的影響。以蛋白提取率為指標(biāo)，分別考察料液比（1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100 g/mL）、超聲時(shí)間（10、20、30、40、50、60 min）、超聲溫度（30、40、50、60、70、80 ℃）、酶添加量（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%）、酶解pH（8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5）、酶解溫度（45、50、55、60、65、70 ℃）、酶解時(shí)間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）共計(jì)7個(gè)因素對(duì)黑木耳蛋白提取率的影響。每個(gè)水平重復(fù)3次，取均值，試驗(yàn)過(guò)程中固定超聲功率為180 W，不變水平值為：超聲時(shí)間30 min、超聲溫度50 ℃、酶解pH為10.5、料液比1:80（g/mL）、酶解時(shí)間2 h、酶添加量5%、酶解溫度40 ℃。

1.2.5 Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)設(shè)計(jì) PB設(shè)計(jì)中，將1.2.4中7個(gè)單因素依次編碼為X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7。對(duì)于每個(gè)因素，均設(shè)定高（+）、低（?）2個(gè)水平，以蛋白提取率（Y）為響應(yīng)值，X1~X7影響因素為自變量，共進(jìn)行12次試驗(yàn)。因素和水平如下表1。

表 1 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 PB experiment design factors and levels

1.2.6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果，選取料液比（A）、超聲時(shí)間（B）、酶解pH（C）和酶解溫度（D）作為Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)（見表2）的4個(gè)自變量，建立響應(yīng)值與自變量之間的函數(shù)關(guān)系，進(jìn)而尋求黑木耳蛋白提取工藝的最優(yōu)組合。

表 2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiment design

1.2.7 黑木耳蛋白提取率的計(jì)算

1.2.7.1 黑木耳總蛋白含量的測(cè)定 參照GB 5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[18]凱氏定氮法，測(cè)得黑木耳粉末中總蛋白含量為（11.38±0.25）g/100 g。

1.2.7.2 黑木耳提取液中蛋白含量的測(cè)定 首先配制不同質(zhì)量濃度的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用考馬斯亮藍(lán)法[19]測(cè)定595 nm處的吸光度值，并做空白對(duì)照，分別以蛋白含量與吸光度值為橫縱坐標(biāo)，繪制牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=4.6925x+0.0808（R2=0.9992）。另外，取黑木耳蛋白提取液，按照上述方法，測(cè)定上清液蛋白含量。

按照式（1）計(jì)算黑木耳蛋白提取率：

1.2.8 黑木耳蛋白等電點(diǎn)（pI）的測(cè)定 稱取6.0 g木耳粉于500 mL燒杯中，加入480 mL的蒸餾水，攪拌溶解，用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH至9.0，40 ℃水浴加熱提取2 h后，8000 r/min離心30 min，取上清液20 mL分裝于50 mL燒杯中，用HCl調(diào)pH分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，重復(fù)試驗(yàn)3次，于4 ℃冰箱中冷沉24 h后，12000 r/min離心15 min，取上清液于595 nm處測(cè)定吸光值，吸光值最低時(shí)的pH即為黑木耳蛋白等電點(diǎn)。

1.2.9 黑木耳蛋白功能特性的測(cè)定

1.2.9.1 起泡性及泡沫穩(wěn)定性的測(cè)定 參照張思思等[20]的方法并做調(diào)整。配制濃度為2%的樣品40 mL，調(diào)節(jié)不同pH為2.0、3.5、5.0、6.5、8.0、9.5，快速分散2 min（9500 r/min），倒出分散液，及時(shí)讀取均質(zhì)停止時(shí)泡沫體積以及均質(zhì)停止30 min后的泡沫體積。計(jì)算公式如下。

1.2.9.2 溶解性的測(cè)定 參照李曉明等[8]的方法并做調(diào)整。稱量一定質(zhì)量的蛋白樣品，配制質(zhì)量濃度為10 g/L，分別量取20 mL待測(cè)樣液，調(diào)節(jié)不同pH為2.0、3.5、5.0、6.5、8.0、9.0，使之充分溶解，室溫條件下攪拌45 min，4000 r/min離心20 min，沉淀不溶蛋白，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液中蛋白含量。計(jì)算公式如下。

1.2.9.3 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測(cè)定 參照薛蕾等[21]的方法并做調(diào)整。配制1%蛋白溶液，量取25 mL樣品于燒杯中，調(diào)節(jié)不同pH為2.0、3.5、5.0、6.5、8.0、9.5，加入相同比例的菜籽油，快速分散2 min（9500 r/min），快速移取25 mL乳化液離心15 min（2500 r/min），將離心管取出立于水平桌面迅速讀取乳化層高度及液體總高度。再將上述乳化液80 ℃水浴30 min，用自來(lái)水冷卻至室溫，離心15 min（2500 r/min），取出讀取并記錄剩余乳化層高度。計(jì)算公式如下。

1.2.9.4 持水性的測(cè)定 參照楊希娟等[22]的方法并做調(diào)整。先對(duì)25 mL離心管進(jìn)行稱重，再稱取0.5 g黑木耳蛋白樣品于離心管中，加入10 mL蒸餾水配成蛋白待測(cè)液，調(diào)節(jié)不同pH為2.0、3.5、5.0、6.5、8.0、9.5，振蕩、混勻，常溫下靜置30 min，使之充分吸水，3000 r/min離心20 min，除去上層水液，稱取離心管和殘留物總質(zhì)量。計(jì)算公式如下。

1.2.9.5 吸油性的測(cè)定 參照張艷榮等[23]的方法并做調(diào)整。先對(duì)10 mL的離心管進(jìn)行稱重，再稱取0.5 g黑木耳蛋白樣品于離心管中，隨后加入10 mL菜籽油，調(diào)節(jié)不同pH為2.0、3.5、5.0、6.5、8.0、9.5，振蕩、混勻，靜置30 min，3000 r/min離心20 min，除去上層油液，稱取離心管和殘留物總質(zhì)量。計(jì)算公式如下。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Design expert 11.0進(jìn)行PB試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)優(yōu)化，試驗(yàn)重復(fù)3次，通過(guò)SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用新復(fù)極差法（Duncan’s）進(jìn)行顯著性分析（P<0.05表示有顯著差異，P<0.01表示有極顯著差異），Origin 2018.0進(jìn)行繪圖處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

探究各因素對(duì)黑木耳蛋白提取率的影響，如圖1所示。

從圖1A可以看出，隨料液比的增大黑木耳蛋白的提取率呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)料液比為1:90（g/mL）時(shí)，蛋白提取率最大。這是因?yàn)殡S溶液體積增大，木耳粉在溶液中的分散度和接觸面積隨之增大，加速蛋白的溶出，提取液用量繼續(xù)增加，超聲破碎不充分[2]，蛋白提取率下降顯著（P<0.05）。故選取料液比1:90（g/mL）進(jìn)行下一步優(yōu)化。

圖1 B顯示，黑木耳蛋白提取率隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降的趨勢(shì)，在30 min破碎效果達(dá)到最佳（P<0.05）。原因可能是超聲波所產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)大大加強(qiáng)了細(xì)胞破碎程度，顯著增大了蛋白溶出速率。30 min后，蛋白提取率開始下降，可能是破碎時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)降解蛋白的酶溶出，破壞了蛋白的結(jié)構(gòu)，機(jī)器產(chǎn)生大量熱使蛋白質(zhì)降解和變性[24]。所以選取超聲時(shí)間為30 min進(jìn)行下一步優(yōu)化。

由圖1C可以看出，黑木耳蛋白提取率隨超聲溫度的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)，蛋白提取率在超聲溫度達(dá)到60 ℃時(shí)最高，超聲溫度繼續(xù)升高，蛋白提取率下降顯著（P<0.05）。原因可能是超聲溫度和超聲過(guò)程中產(chǎn)生的熱效應(yīng)共同作用使溶液體系溫度過(guò)高，引起物料糊化和蛋白質(zhì)變性[25]，提取率下降明顯。所以選取超聲溫度為60 ℃進(jìn)行下一步優(yōu)化。

圖 1 各因素對(duì)黑木耳蛋白提取率的影響Fig.1 Effects of various factors on the extraction rate of Auricularia auriculata protein

圖1 D中，黑木耳蛋白提取率隨酶添加量的增加逐漸升高，當(dāng)酶添加量達(dá)到5%時(shí)，蛋白提取效果最好（P<0.05），然而當(dāng)酶添加量大于5%時(shí)，蛋白提取率開始緩慢下降。原因可能是酶在適宜濃度范圍內(nèi)，伴隨酶添加量的增大，酶加速細(xì)胞壁的降解，使原料中的蛋白更易溶出。當(dāng)酶溶度達(dá)到飽和時(shí)，由于所有底物均已和酶形成中間產(chǎn)物繼續(xù)提高酶的濃度，反而會(huì)使酶促反應(yīng)降低，且酶本身具有競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，故當(dāng)酶添加量超過(guò)一定范圍時(shí)，黑木耳蛋白提取率反而會(huì)降低[26]。所以選取酶添加量為5%進(jìn)行下一步優(yōu)化。

由圖1E所示，黑木耳蛋白提取率隨酶解pH的增大迅速升高，當(dāng)pH到達(dá)8.5時(shí)酶的破壁效果最好，蛋白提取率最高，pH繼續(xù)增大，蛋白提取率下降顯著（P<0.05）。由此可知，黑木耳蛋白提取率隨pH的增大而明顯升高，表明堿性pH能夠疏松蛋白結(jié)構(gòu)，提高蛋白溶解性，但堿性過(guò)強(qiáng)則會(huì)致使蛋白變性，從而破壞蛋白品質(zhì)[25]。故選取酶解pH為8.5進(jìn)行下一步優(yōu)化。

由圖1F可知，黑木耳蛋白提取率隨酶解溫度的升高呈先上升后下降趨勢(shì)。酶活性在溫度為65 ℃時(shí)，達(dá)到最大值，蛋白溶出速率也達(dá)到最大。溫度繼續(xù)升高，酶活性遭到破壞，破壁效果顯著下降（P<0.05），蛋白提取率也隨之降低[27]。所以選取提取酶解溫度65 ℃進(jìn)行下一步優(yōu)化。

圖1 G顯示，黑木耳蛋白提取率隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為1.5 h時(shí)，蛋白提取率最大，此后，延長(zhǎng)酶解時(shí)間提取率下降顯著（P<0.05），原因可能是底物隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷減少，酶解產(chǎn)物的積累抑制了酶的活力，同時(shí)部分溶出蛋白被水解，導(dǎo)致蛋白提取率下降[28]。故選取酶解時(shí)間為1.5 h進(jìn)行下一步優(yōu)化。

2.2 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

根據(jù)表3試驗(yàn)結(jié)果，利用Design-Expert 11.0軟件進(jìn)行多元回歸方程擬合和方差分析，得到以黑木耳蛋白提取率為響應(yīng)值的最優(yōu)回歸方程為：Y=131.42842?0.230957X1+0.236742X2+0.111009X3+0.497741X4?5.37870X5?0.690105X6+4.26641X7。

根據(jù)表4方差分析結(jié)果可知，該模型差異極顯著（P<0.01），R2=0.9713，即有97.13%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)可用該模型解釋。對(duì)黑木耳蛋白提取率的影響極顯著（P<0.01）的因素依次為X6>X5，影響顯著（P<0.05）的因素依次為X2>X1>X7，X3、X4影響不顯著（P>0.05）。因此，選取酶解溫度、酶解pH、超聲時(shí)間和料液比4個(gè)因素進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)。

表 3 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 3 Design scheme and results of PB experiment

表 4 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance results of PB experiment design

2.3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[24]，綜合單因素實(shí)驗(yàn)和PB試驗(yàn)結(jié)果，以黑木耳蛋白質(zhì)提取率作為響應(yīng)值，考察料液比、超聲時(shí)間、酶解pH和酶解溫度4個(gè)因素對(duì)于結(jié)果的影響，以得出最優(yōu)試驗(yàn)條件。Box-Behnken試驗(yàn)方案與結(jié)果見表5，方差分析結(jié)果見表6。

表 5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 5 Design scheme and results of Box-Behnken experiment

對(duì)表5中的數(shù)據(jù)，采用響應(yīng)面方法分析試驗(yàn)結(jié)果，得到黑木耳蛋白提取率（Y）的二次回歸方程為：Y=56.94?1.57A+0.28B+0.43C+1.19D+0.68AB?2.16AC?1.06AD+0.8975BC+0.6825BD+0.01CD?5.68A2?3.78B2?5.18C2?4.47D2。

由表6可知，該模型差異極顯著（P<0.01），決定系數(shù)R2為0.9926，說(shuō)明模型擬合程度良好，能較好地?cái)M合試驗(yàn)結(jié)果。失擬項(xiàng)不顯著（P>0.05），說(shuō)明模型誤差較小，校正決定系數(shù)R2Adj為0.9851，說(shuō)明模型的相關(guān)性和解釋度都很好，可以用此模型進(jìn)行理論分析和預(yù)測(cè)。模型一次項(xiàng)A、D，交互項(xiàng)AC、AD、BC，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)黑木耳蛋白提取率的影響極顯著（P<0.01），一次項(xiàng)C，交互項(xiàng)AB、BD影響顯著（P<0.05）。4個(gè)影響因素中，對(duì)黑木耳蛋白質(zhì)提取率影響最大的為料液比，其次為酶解溫度和酶解pH，影響最小的為超聲時(shí)間。

表 6 Box-Behnken試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 6 Variance analysis results of Box-Behnken experiment

2.4 各因素之間交互作用和響應(yīng)面分析

由Design-Expert 11.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面圖的繪制，通過(guò)3D響應(yīng)面圖能直觀地反映出各因素及因素之間的交互作用對(duì)黑木耳蛋白提取率的影響[29]。響應(yīng)面分析結(jié)果見圖2。

由圖2a、圖2e可以看出，AB、BD響應(yīng)面曲面較陡峭，料液比和酶解溫度的變化曲線比超聲時(shí)間的變化曲線陡峭，說(shuō)明料液比和酶解溫度比超聲時(shí)間的影響都更顯著一些；由圖2b、圖2c、圖2d可知，AC、AD、BC響應(yīng)面曲線陡峭，根據(jù)曲面的陡峭程度，可得出料液比和酶解溫度的交互作用對(duì)蛋白提取率的影響最大，料液比和酶解pH次之，超聲時(shí)間和酶解pH兩者相差不大且影響較小；由圖2f可知，CD響應(yīng)面曲面相對(duì)平緩，兩者交互作用對(duì)蛋白提取率的影響不顯著，與方差分析結(jié)果一致。

2.5 最佳工藝條件的確定及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

Design-Expert 11.0軟件對(duì)試驗(yàn)的優(yōu)化結(jié)果為料液比1:88.34（g/mL）、超聲時(shí)間30.45 min、酶解pH8.54、酶解溫度65.78 ℃，該條件下的蛋白提取率預(yù)測(cè)值為57.19%。采用優(yōu)化后的參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，為方便操作，條件參數(shù)設(shè)為料液比1:88（g/mL）、超聲時(shí)間30.5 min、酶解pH8.5、酶解溫度65.8 ℃，該條件下重復(fù)試驗(yàn)3次，測(cè)得黑木耳蛋白質(zhì)平均提取率為57.11%±0.12%，與模型預(yù)測(cè)值57.19%無(wú)明顯差異，說(shuō)明該模型優(yōu)化得到的黑木耳蛋白提取工藝參數(shù)可靠。

2.6 黑木耳蛋白等電點(diǎn)

探究黑木耳蛋白等電點(diǎn)，如圖3所示。

圖 2 各因素交互作用對(duì)黑木耳蛋白提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plots showing the interaction effects of various factors on the extraction rate of Auricularia auriculata protein

圖 3 黑木耳蛋白等電點(diǎn)Fig.3 Isoelectric point of Auricularia auricular protein

由圖3可知，隨著溶液pH的增大，蛋白吸光度值呈先下降后上升趨勢(shì)，當(dāng)pH為3.5時(shí)，蛋白吸光度值達(dá)到最低值，此時(shí)蛋白正、負(fù)電荷數(shù)相等，凈電荷為零，這可能是因?yàn)榈鞍?水間相互作用和蛋白-蛋白間靜電排斥作用均降低，從而引發(fā)了蛋白聚合沉淀[30]。即pH3.5為黑木耳蛋白的等電點(diǎn)。

圖 4 pH對(duì)黑木耳蛋白起泡性性及泡沫穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of pH on the foaming capacity and foam stability of Auricularia auricular protein

2.7 黑木耳蛋白的功能特性

2.7.1 pH對(duì)黑木耳蛋白起泡性與泡沫穩(wěn)定性的影響

蛋白起泡性是指蛋白樣品在高速攪打過(guò)程中通過(guò)降低水的表面張力，并撲捉氣體最終形成泡沫的能力；保持蛋白泡沫產(chǎn)生后的穩(wěn)定能力即蛋白的泡沫穩(wěn)定性[31]。由于蛋白起泡性與蛋白溶解性有很大的關(guān)系，較高的溶解性、表面膜的強(qiáng)度和表面粘度、分子柔性、親水性基團(tuán)能夠增強(qiáng)蛋白分子與空氣的交互作用，故而對(duì)起泡能力產(chǎn)生一定的影響。

圖4 顯示，黑木耳蛋白起泡性隨pH的增大先下降后上升，而泡沫穩(wěn)定性正好相反。當(dāng)pH為3.5時(shí)，黑木耳蛋白的起泡性最差（17.10%），泡沫穩(wěn)定性最好（74.90%），隨pH的不斷增大，起泡性和泡沫穩(wěn)定性呈相反趨勢(shì)逐漸靠近，當(dāng)pH達(dá)到9.5時(shí)，黑木耳蛋白的起泡性（65.34%）高于其泡沫穩(wěn)定性（58.60%）。這可能是因?yàn)楫?dāng)pH在蛋白等電點(diǎn)附近時(shí)，蛋白容易聚集沉淀，參與形成泡沫的蛋白質(zhì)量濃度較低，使其起泡能力最弱，起泡性最差，此時(shí)，由于溶液中不溶性顆粒通過(guò)靜電作用不斷吸附于氣-液界面，從而增大蛋白膜的黏性和厚度，泡沫穩(wěn)定性隨之增加[21]。

2.7.2 pH對(duì)黑木耳蛋白溶解性的影響 可溶性蛋白在吸水后分散成膠體的性質(zhì)即為蛋白溶解性[21]。不同pH下蛋白溶解性又有很大差異，蛋白的溶解性對(duì)其在食品工業(yè)中的穩(wěn)定性、風(fēng)味等有直接的影響。

從圖5可以看出，蛋白溶解性隨pH逐漸增大呈先下降后上升的U形線。當(dāng)pH為3.5時(shí)蛋白溶解性最低（10.72%），歸因于在等電點(diǎn)附近蛋白發(fā)生聚集沉淀，容易析出；當(dāng)溶液體系pH大于或小于3.5時(shí)，黑木耳蛋白-蛋白以及蛋白-水分子之間相互作用增強(qiáng)，凝聚力下降，促進(jìn)溶解，蛋白溶解性隨溶液酸性或堿性的增強(qiáng)不斷增大。

圖 5 pH對(duì)黑木耳蛋白溶解性的影響Fig.5 Effect of pH on the solubility of Auricularia auricular protein

2.7.3 pH對(duì)黑木耳蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

在高速攪拌下，蛋白使油被均勻分散在水中形成乳狀液的能力叫蛋白乳化性；維持蛋白乳化液穩(wěn)定且不出現(xiàn)油水兩項(xiàng)明顯分離的能力即蛋白乳化穩(wěn)定性，溶液pH、離子濃度、溫度和蛋白質(zhì)濃度都對(duì)蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性有不同程度的影響。

從圖6可知，黑木耳蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性都隨pH的增大呈先下降后上升的趨勢(shì)。這是由于當(dāng)pH為3.5時(shí)即黑木耳蛋白的等電點(diǎn)，此時(shí)凈電荷為零，蛋白之間靜電排斥力最小，蛋白溶解性最低，乳化性（20.56%）和乳化穩(wěn)定性（54.56%）的能力都最小；但當(dāng)pH在遠(yuǎn)離蛋白的pI時(shí)，黑木耳蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性呈相同趨勢(shì)增強(qiáng)，前者較后者增幅更明顯，由于黑木耳蛋白與水分子之間相互作用增強(qiáng)，溶于體系溶液的能力增強(qiáng)，靜電斥力增大，油/水界面的吸附能力增強(qiáng)，界面張力降低，蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性都隨之增強(qiáng)[32]。

圖 6 pH對(duì)黑木耳蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of pH on the emulsifying property and emulsifying stability of Auricularia auricular protein

2.7.4 pH對(duì)黑木耳蛋白持水性的影響 蛋白中親水性基團(tuán)與水結(jié)合即吸附水的能力為蛋白持水性，溶液體系的pH和溫度對(duì)蛋白的持水性有一定的影響；良好的持水性有助于食品貯藏過(guò)程中的“保鮮”和“成型”，保持食品足夠的水分，從而降低水分損失，防止食品收縮[32]。

圖7 可見，黑木耳蛋白的持水性隨pH的增大呈先下降后上升的趨勢(shì)。pH在蛋白等電點(diǎn)3.5時(shí)，持水性（2.7 g/g）最小，這是因?yàn)樘幱诘入婞c(diǎn)時(shí)的蛋白總電荷為零，分子間相互作用最大，締合和收縮的蛋白質(zhì)呈現(xiàn)最低的水化和膨脹[21]；而當(dāng)pH遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，蛋白以離子形式存在，使蛋白溶脹性能和黏度增加，持水性增強(qiáng)。

圖 7 pH對(duì)黑木耳蛋白持水性的影響Fig.7 Effect of pH on the water holding capacity of Auricularia auricular protein

2.7.5 pH對(duì)黑木耳蛋白吸油性的影響 蛋白的吸油性是指在一定條件下，蛋白與油脂按一定比例混合后吸附油脂的能力。影響蛋白吸油性的因素有很多，如：蛋白種類、溫度及油品，同時(shí)蛋白良好的吸油性在肉制品的加工生產(chǎn)中起著很重要的作用。

由圖8可知，黑木耳蛋白的吸油性隨pH的增大呈先下降后上升并趨于平緩的趨勢(shì)。當(dāng)pH為3.5時(shí)蛋白吸油性最小（2.38 g/g），pH繼續(xù)升高，蛋白吸油性上升顯著（P<0.05），當(dāng)pH為9.5時(shí)達(dá)到最大值（2.90 g/g），原因可能是當(dāng)pH在蛋白等電點(diǎn)附近時(shí)，蛋白容易聚集沉淀，吸油性最小；隨pH升高，蛋白分子發(fā)生伸展、解離，內(nèi)部非極性鍵暴露且油脂結(jié)合能力增大。pH繼續(xù)升高，部分蛋白發(fā)生變性，結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，分子間的相互作用減小，吸附能力減弱[33]。

圖 8 pH對(duì)黑木耳蛋白吸油性的影響Fig.8 Effect of pH on the oil absorption capacity of Auricularia auricular protein

3 結(jié)論與討論

各因素對(duì)蛋白提取率影響的主次順序?yàn)榱弦罕?酶解溫度>酶解pH>超聲時(shí)間；最適提取工藝參數(shù)為料液比1:88（g/mL）、超聲時(shí)間30.5 min、酶解pH8.5、酶解溫度65.8 ℃，獲得的理論值為57.19%，該條件下，經(jīng)驗(yàn)證實(shí)際值為57.11%±0.12%，證明該模型準(zhǔn)確可靠。張莉等[1]采用堿溶酸沉法提取黑木耳蛋白，提取率為64.8%；林洋[34]采用超聲輔助堿法提取黑木耳蛋白，提取率為48.3%；與之相比，采用超聲波-酶法提取黑木耳蛋白，提取率居中，由于實(shí)驗(yàn)條件限制，未能探究超聲功率高于180 W以后對(duì)黑木耳蛋白提取率的影響，但依據(jù)結(jié)果可以認(rèn)為超聲波-酶法是一種有效的蛋白提取方法。

pH對(duì)黑木耳蛋白功能特性的影響顯著。pH3.5時(shí)蛋白泡沫穩(wěn)定性最好，達(dá)到74.90%；隨pH增大（3.5~9.5），溶解性、起泡性、乳化性、乳化穩(wěn)定性、持水性和吸油性顯著提高（P<0.05），泡沫穩(wěn)定性顯著下降（P<0.05）。在適宜的pH條件下，黑木耳蛋白具有較好的溶解性、乳化性、乳化穩(wěn)定性、泡沫穩(wěn)定性，可將其添加至飲料、蛋糕、湯料等食品中。

后期實(shí)驗(yàn)可從以下幾方面展開：探究黑木耳蛋白功能特性與溫度、離子強(qiáng)度、蛋白質(zhì)量濃度的關(guān)系和影響規(guī)律；通過(guò)脫色、超濾、離子交換色譜等技術(shù)分離純化蛋白，以獲得更高純度的蛋白，進(jìn)行其結(jié)構(gòu)鑒定、理化性質(zhì)研究；進(jìn)一步研究黑木耳蛋白的抗氧化活性、功能性產(chǎn)品的開發(fā)等。本研究結(jié)果為今后黑木耳蛋白的提取工藝以及在食品加工中的應(yīng)用提供了相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)支撐，同時(shí)也為黑木耳的精深加工提供新的思路，盡而有效的提升黑木耳的附加值。