Plackett-Burnman聯合響應面法優化黑果枸杞黃酮提取工藝及抗氧化性研究

王春林，武 蕓，蘆婭妮，韓明虎，王麗朋，胡浩斌

（1.隴東學院生命科學與技術學院，甘肅慶陽 745000；2.隴東學院化學化工學院，甘肅慶陽 745000）

黑果枸杞具有抗炎[1]、增強腸道屏障功能[2]、抗氧化[3?6]、抗疲勞[7?8]、防痛風性關節炎[9]、抗動脈粥樣硬化[10]、防治心腦血管疾病[11]等功效，富含花青素、多糖、多酚、黃酮等多種天然有效成分，主產于我國新疆、甘肅、青海、寧夏等地[12]。黃酮類化合物（Flavonoids）是一類植物次生代謝產物，其抗氧化性是化學合成抗氧化劑的3~5倍，天然無毒，極具開發前景[13]。李淑珍[14]以新疆產黑果枸杞葉為原料，測定了其總黃酮含量并優化了提取工藝，使總黃酮提取率達到了0.23%。段亞云等[15]、韓愛芝等[16]分別采用響應面技術優化了超聲波-微波協同提取、超聲輔助提取黑果枸杞葉總黃酮的工藝條件，提取率分別達到了0.997%和1.62%。古麗巴哈爾·卡吾力等[17]以新疆塔里木盆地產黑果枸杞為原料，采用水提法，通過單因素實驗與響應面法優化了黑果枸杞黃酮提取工藝，總黃酮提取量達到了69.02 μg/mL。同時，相關研究發現黑果枸杞黃酮具有明顯的體外抗氧化性[17?18]、降血脂功效[19?20]、抑制Hep G-2肝癌細胞增殖作用[21?22]。綜上所述，關于黑果枸杞總黃酮提取及生物活性研究，多見于新疆產黑果枸杞葉中的黃酮類化合物，其它主產區數據尚缺，從黑果枸杞果實中提取黃酮化合物的報道也較為少見。

植物有效成分提取中需考慮到多個影響因素，通常的單因素實驗結合響應面設計導致工作費時費力且優化工藝具有盲目性、缺乏精準性。Plackett-Burman（PB）是一種近飽和的兩水平篩選試驗設計方法，能用最少的試驗次數快速有效地篩選出顯著性影響因子[23]，最陡爬坡實驗可依據PB實驗結果確定爬坡方向，快速聚焦響應面中心區域，Box-Behnken（BB）響應面設計采用多元線性和二次項模型擬合，可較好地體現依賴變量與非依賴變量之間的關系，對回歸方程分析尋求最佳工藝參數[24]。

本研究以甘肅產黑果枸杞干果為原料，采用超聲輔助提取其總黃酮，通過PB、最陡爬坡實驗及BB聯合實驗設計對提取工藝進行優化，并對其抗氧化性進行了評價，一方面可為黑果枸杞研究填補數據空白，有利于黑果枸杞資源開發利用，另一方面為植物有效成分提取工藝研究提供可供參考的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑果枸杞 2018年6月至8月產自甘肅省民勤縣；抗壞血酸（批號Lot.No 1018P032）、DPPH（批號Lot.No 102D021）、ABTS（批號Lot.No 109A021）

北京索萊寶科技有限公司；氫氧化鉀、無水乙醇、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、過硫酸鉀 均為分析純。

FZ102微型植物試樣粉碎機 北京中興偉業儀器有限公司；SB-5200DTD型超聲波清洗機 寧波新芝生物科技有限公司；7230G可見分光光度計上海精密科學儀器有限公司；PHS-3C酸度計 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑果枸杞黃酮提取方法 黑果枸杞原料經30 ℃鼓風干燥48 h、粉碎，取100目標準篩篩下物，干燥器中?5 ℃保存。準確稱取0.5 g，置于裝有15 mL 51%乙醇的錐形瓶中，62 ℃下提取42 min，超聲功率240 W，冷卻至室溫后離心分離，取上層清液于25 mL容量瓶中，蒸餾水定容。

1.2.2 單因素實驗 以黑果枸杞總黃酮提取率（Total flavonoids content，TFC）為評價指標，各因素考察參數及固定水平如表1所示。

表 1 單因素實驗各因素考察參數及固定水平Table 1 Parameters and fixed level of each factor in single factor experiments

1.2.3 PB實驗-最陡爬坡試驗 根據單因素實驗結果，分別對每個影響因子取高低兩水平通過Minitab 17.1.0軟件進行PB篩選試驗設計，選取的因素及水平見表2。其次，在PB試驗的基礎上，分析實驗所得一次多項式及各因素的正負效應，確定爬坡方向和步長，進行最陡爬坡試驗設計。

表 2 PB實驗設計中的因素及水平Table 2 Factors and levels tested in PB design

1.2.4 響應面試驗 根據最陡爬坡試驗結果，聚焦響應面中心區域，選取顯著性因素及水平，非顯著性影響因素保持單因素實驗中最高提取率對應值，液料比30:1 mL/g，超聲功率240 W，見表3，采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面設計及優化分析。

表 3 響應面因素及水平Table 3 Factors and levels in response surface design

1.2.5 總黃酮提取率測定 將提取液稀釋適當倍數作為測試液。參照課題組前期研究成果中的方法測定總黃酮濃度，并根據式（1）計算黃酮提取率，提取率以mg/g（原料）表示，后面簡寫為mg/g[25]。

式中：ρ：總黃酮提取率，mg/g；C：測試液總黃酮濃度，μg/mL；DF：稀釋倍數，50；m：原料質量，g；V：提取液體積，25 mL；1000：單位換算系數。

1.2.6 黑果枸杞黃酮抗氧化性測定 參考Pavli?等[26]與Sarikurkcy等[27]的方法并根據實驗經驗稍作修改。抗壞血酸與黃酮保持相同濃度和方法做平行對比。

1.2.6.1 FRAP實驗 將黑果枸杞黃酮提取液稀釋至濃度分別為0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20 mg/mL的樣品測試液。2.5 mL磷酸緩沖液（pH=6.6）及1%鐵氰化鉀溶液加入1 mL測試液中，混合、50 ℃水浴中保持20 min后，常溫下加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，離心分離、取上層清液2.5 mL，與2.5 mL蒸餾水與0.1%氯化鐵溶液混合，靜置，測定700 nm的吸光度。

1.2.6.2 ABTS實驗 將黑果枸杞黃酮提取液稀釋至濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL的樣品測試液。將7 mmol ABTS與140 mmol過硫酸鉀按5 mL:88 μL混合，室溫下暗處放置12~16 h，形成ABTS自由基儲備液，避光保存，使用時稀釋為A734 nm在0.695~0.705范圍即可。測定時，取300 μL配制好的樣品溶液或抗壞血酸溶液與3.7 mL ABTS自由基稀釋液，混合、靜置，測定734 nm的吸光度。

1.2.6.3 DPPH實驗 將黑果枸杞黃酮提取液稀釋至濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08、0.10 mg/mL的樣品測試液。取0.5 mL測試液及4.0 mL DPPH無水乙醇溶液（0.15 mmol/L）于帶刻度具塞試管中，用無水乙醇稀釋至6 mL，混勻、避光放置一定時間，測定517 nm的吸光度。采用相同的方法分別測定用無水乙醇代替DPPH溶液和4.0 mL DPPH溶液與2.0 mL無水乙醇的混合液在517 nm的吸光度。同法評價抗壞血酸DPPH自由基清除能力。

ABTS與DPPH自由基清除率均采用式（2）計算。

式中：S為清除率；Ai為測試液吸光度；Aj為樣品溶液吸光度；A0為未加樣品對照液吸光度。

1.3 數據處理

采用Origin 8.0軟件作圖、Mintab 17.1.0軟件進行Plackett-Burman實驗設計與數據處理與統計差異比較、Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面設計及優化分析與統計差異比較，每組實驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 黑果枸杞黃酮提取工藝的優化

2.1.1 單因素實驗結果 由圖1可以看出，50%乙醇溶液對黑果枸杞黃酮的提取率最高，推測其與黑果枸杞黃酮極性最相似；提取時間40 min時，黃酮提取率不再增加，繼續延長提取時間提取率變化不大；提取溫度太低不利于傳質，太高則會破壞黃酮結構、降低其生物活性，70 ℃較佳；當液料比達到30:1（mL/g）時，黑果枸杞黃酮溶出量最大，再增大溶劑用量，會導致溶出雜質增多，降低總黃酮在溶出物中的比例而使其純度下降；超聲功率240 W時提取效果較佳。因此，較佳的提取工藝為：乙醇體積分數50%、提取時間40 min、提取溫度70 ℃、液料比30:1 mL/g、超聲功率240 W，以其為參考值進行后續實驗設計。

圖 1 單因素實驗結果Fig.1 Results of single factor experiment

2.1.2 PB實驗設計及結果 按前述方法進行PB實驗設計，各組實驗提取率如表4所示。

表 4 PB實驗設計及結果Table 4 PB experimental design and results

采用Minitab 17.1.0軟件對PB實驗結果分析與模型擬合，結果見表5。

由表5可知，模型的“P<0.001”、F=41.53，說明實驗擬合模型達到了0.1%顯著水平；從相關系數來看，R2=0.9719，R2（predicted）=0.8877，R2（adjusted）=0.9485均與1接近，說明擬合得到的一次多項式Y=31.519?1.548A?2.711B+2.619C+0.531D+0.301E與實驗基本相符，可用來判別各種影響因素的顯著性。表6為各因素的正負效應系數、顯著性數值及影響排名。

2.1.3 最陡爬坡試驗 由表7可知，第5組提取率最高，所以以第5組實驗對應的顯著性影響參數為響應面中心進行響應面設計。

表 5 PB實驗方差分析Table 5 Variance analysis results of PB design

2.1.4 響應面試驗 依據實驗結果，采用Design expert 8.0.6軟件進行多元回歸擬合，得到二次多項式TFC=40.98+0.17A?0.29B+0.20C+0.40AB+0.28AC?0.95BC?1.57A2?1.03B2?1.38C2，統計分析結果見表8和表9。

由表9可知，模型F=50.50，P<0.0001，說明模型達到了0.1%顯著水平，并且R2=0.9848，R2adj=0.9653，R2pred=0.9040、失擬項P=0.6199>0.05，說明模型預測性良好且失擬程度不顯著，具有統計學意義。另外，各項顯著性因素統計分析表明，其顯著性大小順序為：B>C>A，這與Plackett-Burnman試驗分析結果一致，結論相互佐證，說明實驗過程誤差小，并且B，AB達到了5%顯著性水平，BC，A2，B2，C2等二次項達到了0.1%顯著性水平。

表 6 各因素的正負效應及顯著性Table 6 Positive and negative effects and significance of each factor

表 7 最陡爬坡試驗設計及結果Table 7 Experimental design and result in steepest ascent method

表 8 Box-Behnken試驗設計及結果Table 8 Experimental design and results in Box-Behnken

表 9 Box-Behnken實驗結果方差分析Table 9 ANOVA results of Box-Behnken design

依據數據模擬結果，繪制3D響應面圖，見圖2。由圖2可知，所形成的響應曲面均中心凸起四周下降，說明通過最陡爬坡實驗選取的響應面中心準確，實驗中選取各因素水平范圍覆蓋了最高提取率的工藝條件，通過模型預測的最佳提取工藝是科學合理的。

圖 2 響應面3D圖Fig.2 Response surface 3D graph

2.1.5 最優條件及驗證 解析所得二次多項式，并根據儀器實際操作精確度做近似處理，得到超聲輔助提取黑果枸杞黃酮的最佳工藝條件為：乙醇體積分數51%，提取溫度62 ℃，提取時間42 min，液料比30:1，超聲功率240 W，并進行三次驗證實驗，平均提取率為42.0974 mg/g，與預測值的相對標準偏差為3.24%，說明該擬合模型可靠、最佳工藝條件準確。

2.2 黑果枸杞黃酮抗氧化性

2.2.1 FRAP還原力 由圖3可知，隨著黑果枸杞黃酮樣品與抗壞血酸濃度增大，吸光度逐漸增大，說明其還原力增強，并且黑果枸杞黃酮的還原力強于抗壞血酸，與李進等[18]報道的黑果枸杞葉黃酮還原力實驗結果基本一致，但吸光度整體偏小，可能由于黑果枸杞黃酮來自不同地域的植物和植物不同部位而表現出差異，同時推測黑果枸杞黃酮是良好的電子供應者。

圖 3 黑果枸杞黃酮及抗壞血酸的還原力Fig.3 Reducing power of Lycium ruthenicum Murr.polyphenols and ascorbic acid

2.2.2 ABTS總抗氧化力 由圖4可知，黑果枸杞總黃酮與抗壞血酸對ABTS+自由基的清除率均隨自身濃度增大而增大，在0.05 mg/mL時，黑果枸杞黃酮與抗壞血酸的清除率分別達到96.68%和93.63%，說明黑果枸杞黃酮與抗壞血酸均具有很強的ABTS+自由基清除能力，IC50分別為0.0252 、0.0279 mg/mL，說明黑果枸杞黃酮的ABTS+自由基清除力略強于抗壞血酸。原因可能是黃酮類化合物具有多羥基，黃酮類化合物結構中的3-OH，5-OH，2、3位雙鍵，B環中的4'-OH，3'，4'鄰位雙羥基是抗氧化的有效基團，能與自由基反應，形成共振穩定的半醌式自由基，共振半醌式自由基的穩定性越大，黃酮類化合物的抗氧活性越強[28]。

圖 4 黑果枸杞黃酮及抗壞血酸的ABTS+自由基清除能力Fig.4 ABTS+· scavenging force of Lycium ruthenicum Murr.polyphenols and ascorbic acid

2.2.3 DPPH自由基清除能力 穩定自由基DPPH的乙醇溶液呈紫色，在517 nm處有最大吸收，抗氧化劑具有遞電子或遞質子的能力，對DPPH自由基的清除作用是抗氧化劑將電子或質子傳遞給DPPH自由基，從而生成穩定的分子態的結果[29]。由圖5可知，黑果枸杞黃酮與抗壞血酸清除DPPH自由基作用均較強，IC50分別為0.0272、0.0287 mg/mL。濃度0.01~0.06 mg/mL時，兩者對DPPH自由基清除率隨濃度增大急劇上升，達到0.06 mg/mL時，兩者的清除率都大于90%并趨于穩定，此后清除作用增加不明顯，整個過程二者對DPPH自由基的清除率無明顯差異，本實驗中的黃酮樣品對DPPH自由基的清除能力低于古麗巴哈爾·卡吾力等[17]報道的新疆黑果枸杞黃酮，與李兆君等[30]報道的寧夏黑果枸杞黃酮清除能力基本一致。

圖 5 黑果枸杞黃酮及抗壞血酸的DPPH自由基清除能力Fig.5 DPPH· scavenging force of Lycium ruthenicum Murr.polyphenols and ascorbic acid

3 結論

本研究以甘肅產黑果枸杞為原料，采用PB實驗設計聯合最陡爬坡實驗與BB實驗設計進行黃酮提取工藝優化，最佳提取工藝條件為：以51%乙醇（體積分數）為提取劑，加入與原料比30:1（mL/g）的量，62 ℃、240 W提取42 min，提取率可達42.0974 mg/g。

同時，以抗壞血酸為陽性對照，較全面地評價了黑果枸杞黃酮的抗氧化性，得出黑果枸杞黃酮具有較強的還原力，對ABTS+自由基、DPPH自由基的清除作用表明，其IC50分別為0.0252、0.0272 mg/mL均略強于抗壞血酸的0.0279、0.0287 mg/mL，抗氧化能力與濃度正相關。實驗中對抗氧化性考察的實驗項目有限，本課題組會在后續研究中繼續探索黑果枸杞黃酮對其它自由基的清除作用，采用HPLC或MS對提取物黃酮單體化合物進行定性定量研究。

綜上所述，黑果枸杞黃酮可作為一種安全的天然抗氧化物，具有較高的應用價值和潛在經濟效益，本文研究成果可為黑果枸杞開發應用、深加工、精加工提供一定的理論依據。