響應面法優化野菊花蒙花苷的提取工藝及大悟縣不同區域野菊花中蒙花苷含量的測定

喻書誠，王思龍，張 林，王有寧，李長春，湯亞芳，斯琴朝克圖，劉 牛，鄭 操,2, ，姚國新,

（1.湖北工程學院生命科學技術學院，湖北省植物功能成分利用工程技術研究中心，湖北孝感 432000；2.湖北工程學院特色果蔬質量安全控制湖北省重點實驗室，湖北孝感 432000）

野菊花（Chrysanthemum indicumL.）又名苦薏，味苦、辛，性涼,具有廣譜抗菌、抗病毒、降壓、疏散風熱、解毒護肝的藥用效力[1?3]。野菊花喜涼爽濕潤氣候，耐寒，在我國分布較為廣泛。孝感市大悟縣地處東北部鄂豫邊界，大別山西南段[4]，為典型的亞熱帶季風氣候，四季分明、雨水充沛，適宜野菊花的生長，野菊花也因此成為了當地著名的特色資源。“十四五”時期以來，鄉村振興戰略全面進入發力期，大力發展農村經濟、建設高水平的農村全面小康、全面提高脫貧質量已刻不容緩[5]。孝感市大悟縣作為革命老區和擁有諸多全國著名紅色旅游景點[6]，地處偏僻山區[7]，旅游業難以發展，亟待尋求其他方式以促進當地經濟高速、高質量發展。野菊花作為一種藥食兩用的植物，自古以來即得到廣泛應用。在食品材料方面，由于其顏色鮮艷、氣味物質復雜，氣味獨特芬芳[8]，因而常被作為茶飲、食品色素添加劑以及風味調節劑等。黃芳等[9]在野菊花黃色素的相關研究中發現，野菊花黃色素作為食品添加劑不僅具有較好的穩定性，還具有較好的抗氧化能力，是一種優良的植物色素。

據報道，野菊花含有的主要活性成分包括黃酮類物質、揮發油類以及多種微量元素[10]。蒙花苷就是野菊花中一種重要的黃酮類化合物，具有顯著的抗菌消炎[11?14]、抗衰老[15]、抗腫瘤[16]、降糖降壓[17?18]功效。研究表明，酶預處理技術[19?22]與微波輔助等[23]技術能夠有效提取植物中活性組分，提升了目標產物得率。例如，孫平等在微波輔助新型溶劑提取野菊花總黃酮的研究中，采用響應面法對溶劑含水量、料液比、溫度、提取時間、超聲功率進行優化，確定出最佳條件為溶劑含水量28%、料液比1:25（g:mL）、微波功率450 W、提取時間38 min的微波提取法，對野菊花總黃酮的提取率達到了62.16 mg/g[24]；張明等采用正交試驗設計的方法，優化了野菊花中蒙花苷回流提取過程，確定出80%乙醇、液料比1:8、提取3次，每次提取2 h的最優回流提取方案[25]。目前，相關研究主要集中于對野菊花蒙花苷含量測定方法的建立[26?27]或是采用正交試驗的方式優化提取工藝參數，且提取次數較多，時間較長[2,28]，尚且缺乏對于最優工藝能否用于測定蒙花苷絕對含量的可行性驗證，和用于真實樣本中蒙花苷定量的系統研究。

本試驗以常規的溶劑回流提取法為基礎，采用Box-Behnken響應面試驗，以蒙花苷的得率作為評價指標，對能夠影響蒙花苷得率的主要因素（溶劑種類、溶質質量百分數、提取時間、提取溫度、液料比）進行優化，以獲得最優的工藝參數，為蒙花苷提取工藝的制定提供理論依據。同時，以最優的工藝條件，對孝感市大悟縣各地區采集的野菊花樣品進行蒙花苷含量測定，以期在優化提取工藝的同時，找到最有利于野菊花合成蒙花苷的種植區域，為大悟縣種植富含蒙花苷的野菊花提供指導，為該地蒙花苷提取分離的產業化提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

野菊花樣品 于2020年11月1~5日（野菊花盛花期），采自孝感市大悟縣全縣內不同區域，共計121份樣品；色譜級甲醇 國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇 中天化工有限責任公司；蒙花苷標準品 上海源葉生物科技有限公司。

DZKW-S-6型恒溫水浴鍋 北京市永光明醫療儀器有限公司；HITACHI高效液相色譜儀 日本日立公司；超純水儀 成都滲源科技有限公司；離心機

北京時代北利離心機有限公司；超聲儀 上海之信儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 野菊花采樣及樣本的預處理 孝感市大悟縣野菊花樣本采樣工作，按4 km×4 km方格網布置采樣區，全縣共設121個采樣區（圖1），覆蓋全縣17個鄉鎮。野菊花樣本按規范采集，同時借助手機奧維地圖選點定點定位各采樣點。篩選品質好的野菊花，沖洗干凈去掉葉梗，花序105 ℃殺青5 min，80 ℃烘至恒重，以粉碎機粉碎，過60目篩，粉末置于干燥器中備用。

1.2.2 野菊花蒙花苷的提取 精密稱取一定量經過預處理的野菊花樣品，置于100 mL具塞三角瓶中，加入一定量的溶劑，設定溫度及提取時間，采取回流法進行野菊花蒙花苷的提取[29]。將回流提取后的樣品置于離心管離心，測量上清液體積，并取少量樣液過0.22 μm微孔濾膜,濾液稀釋10或20倍，以備后續進行HPLC分析。

1.3 提取工藝優化

工藝優化實驗均以第27號采集樣本為材料，進行蒙花苷的提取和含量測定。

1.3.1 單因素實驗 稱取一定量的野菊花粉末，在其他條件保持不變的情況下，進行回流提取，分別考察溶劑種類、溶質質量分數、提取時間、液料比、提取溫度等因素對蒙花苷得率的影響。

1.3.1.1 溶劑種類對蒙花苷得率的影響 稱取野菊花干粉樣品0.05 g，選擇甲醇、乙醇兩種溶劑提取，確定溶質質量分數為60%、液料比為200:1（mL/g），在60 ℃下回流提取30 min，提取液處理后測量蒙花苷濃度并通過計算得出蒙花苷得率，以確定較優溶劑種類。

1.3.1.2 溶質質量分數對蒙花苷得率的影響 稱取野菊花干粉樣品0.05 g，設置溶質質量分數梯度為30%、40%、50%、60%、70%，確定溶劑為乙醇，在提取溫度為60 ℃、液料比為200:1（mL/g）、回流提取時間為30 min的條件下，進行回流提取，提取液處理后測量蒙花苷濃度，計算得出蒙花苷得率，以確定較優溶質質量分數。

1.3.1.3 提取時間對蒙花苷得率的影響 稱取野菊花干粉樣品0.05 g，設置提取時間梯度為15、30、45、60、75 min，確定溶劑為60%的乙醇，在提取溫度為60 ℃、液料比為200:1（mL/g）的條件下，回流提取，提取液處理后測量蒙花苷濃度，計算得出蒙花苷得率，以確定較優提取時間。

1.3.1.4 液料比對蒙花苷得率的影響 稱取野菊花干粉樣品0.2 g，設置液料比梯度為50:1、100:1、150:1、200:1、250:1（mL/g），確定溶劑為60%的乙醇，在提取溫度為60 ℃的條件下，回流提取30 min，提取液處理后測量蒙花苷濃度，計算得出蒙花苷得率，以確定較優液料比。

1.3.1.5 提取溫度對蒙花苷得率的影響 稱取野菊花干粉樣品0.2 g，設置溫度梯度為40、50、60、70、80 ℃，確定溶劑為60%的乙醇，在液料比為200:1（mL/g）的條件下，回流提取30 min，提取液處理后測量蒙花苷濃度，計算得出蒙花苷得率，以確定較優提取溫度。

1.3.2 響應面試驗 基于單因素實驗優化的結果，采用Design Expert 8，進行Box-Behnken方法設計4因素3水平響應面試驗，因素與水平設計見表1。根據響應面構建的數據模型確定最優的提取工藝參數。

1.4 蒙花苷含量測定

1.4.1 色譜條件 C18反向色譜柱（Agilent TC-C18250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水-磷酸（體積比為57:43:0.04）；檢測波長：326 nm[30]；柱溫箱：25 ℃；流速：1 mL/min；進樣量：20 μL；檢測時間：15 min。

1.4.2 標準曲線的建立 精密量取蒙花苷標準品，用甲醇溶解制成10、5、2.5、1、0.5、0.25、0.1 mg/L系列濃度的標準品溶液，采用高效液相色譜法測定，以標準品溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，制作標準曲線，以峰面積（y）對標準品濃度（x）進行回歸分析，得到方程：y=24109.86x+460.47，其決定系數R2=0.99996，用此方程可以精確計算出野菊花樣本中蒙花苷的濃度與含量。

1.4.3 蒙花苷得率的計算 以HPLC分析，積分計算樣品溶液蒙花苷吸收峰面積，帶入標準曲線方程計算蒙花苷濃度。

式中：c：樣品蒙花苷濃度（mg/mL）；V：樣品溶液總體積（mL）；n：稀釋倍數；m：野菊花粉末質量（g）。

1.5 孝感市大悟縣不同地區野菊化蒙花苷含量測定

采用1.3.2響應面實驗優化的工藝參數，對大悟縣各地121份野菊花樣品進行蒙花苷含量測定，以確定最有利于大悟縣野菊花蒙花苷生成并積累的種植區域。

1.6 數據分析

所有樣品測量數據至少3個平行樣，以算術平均值表示，方差分析（ANOVA）采用IBM SPSS Statistics 24進行Duncan檢驗，P值小于0.05表示數據之間的差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 溶劑種類對蒙花苷得率的影響 野菊花蒙花苷得率受溶劑種類影響的結果如圖2所示。3次平行實驗平均得率分別為甲醇：1.921%；乙醇：1.804%，經單因素方差分析，兩者差異并不顯著（P>0.05）。因此將價格更低的乙醇作為最優提取溶劑。

圖 2 溶劑種類對蒙花苷得率的影響Fig.2 Effect of solvent type on the yield of buddleoside

2.1.2 溶質質量分數對蒙花苷得率的影響 野菊花蒙花苷得率受溶質質量分數影響的結果如圖3所示。當乙醇質量分數處于30%~60%時，野菊花樣本蒙花苷的得率隨質量分數的增大而提高；當質量分數大于60%時，蒙花苷得率隨乙醇質量分數的提升反而下降。推測原因可能是過高的乙醇質量分數使得蒙花苷的溶出率已趨近飽和，同時使得其他醇溶性物質的溶出增多，導致蒙花苷得率反而下降的情況出現。綜合考慮，40%~60%為較優的溶質質量分數。

圖 3 溶質質量分數對蒙花苷得率的影響Fig.3 Effect of solute mass fraction on the yield of buddleoside

2.1.3 提取時間對蒙花苷得率的影響 野菊花蒙花苷得率受提取時間影響的結果如圖4所示。在45 min以前，樣本中蒙花苷的得率隨提取時間的增加而增加，并在45 min處達到峰值，而在45 min之后，得率反而會隨提取時間的增加而下降，推測可能是蒙花苷的溫度穩定性不強[30]，長時間的回流提取導致了蒙花苷的降解，或長時間的提取導致樣品中其余成分大量溶出，使蒙花苷得率降低。由此可見，45 min為較優提取時間。

圖 4 提取時間對蒙花苷得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of buddleoside

2.1.4 液料比對蒙花苷得率的影響 野菊花蒙花苷得率受液料比影響的結果如圖5所示。隨著溶劑體積的上升，得率逐漸增大，并當溶劑與干粉的比值為200:1（mL/g）時，得率達到最高點。隨后，蒙花苷得率隨液料比的進一步增大而開始下降，可能原因是蒙花苷的溶出已達到飽和，溶劑體積的進一步增加，促進了樣品中其他成分的溶出。因此，200:1（mL/g）是較為優異的液料比。

圖 5 液料比對蒙花苷得率的影響Fig.5 Effect of liquid-solid ratio on the yield of buddleoside

2.1.5 提取溫度對蒙花苷得率的影響 野菊花蒙花苷得率受提取溫度影響的結果如圖6所示。當提取溫度低于60 ℃時，蒙花苷的得率隨溫度上升而增加，在60 ℃時達到峰值，并會隨溫度的進一步提升而下降。分析原因可能是，蒙花苷屬于熱敏感性化合物[31?32]，較高的提取溫度會破壞蒙花苷結構，導致降解。因此，60 ℃為較優提取溫度，后續考察60~80 ℃。

圖 6 提取溫度對蒙花苷得率的影響Fig.6 Effect of extraction temperature on the yield of buddleoside

2.2 響應面分析

2.2.1 響應面試驗優化結果 采用Design Expert 8軟件進行分析，將表2中的實驗數據進行多元方程擬合，得到野菊化蒙花苷得率Y方程如下：

由表3可知，回歸模型F=48.06，P<0.0001，差異達到極顯著水平。模型的決定系數R2=0.9796，調整決定系數R2adj=0.9592，說明該模型可以應用于解釋95.92%的因變量變化情況，擬合度較高，實驗誤差較小。失擬項P=0.5875，大于0.05，差異不顯著，說明未知因素對實驗結果的影響較小，表明模型選擇合適，可以應用于對野菊花蒙花苷提取工藝優化進行分析。回歸方程中一次項A（溶質質量分數）、B（提取時間）、C（液料比）、D（提取溫度）對樣品中蒙花苷得率的影響均達到了極顯著水平（P<0.01），其中影響主次因素為D>B>C>A；交互項AD（溶質質量分數與提取溫度）、BC（提取時間與液料比）、BD（提取時間與提取溫度）三項對得率的影響均達到極顯著水平（P<0.01），其中影響效果BC>AD>BD；交互項AC（溶質質量分數與液料比）為顯著水平（P<0.05）；二次項A2、D2均達到極顯著水平（P<0.01），其中A2>D2。

表 2 響應面實驗設計和結果Table 2 Experimental design and results of the response surface experiment

表 3 響應面回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of response surface regression equation

2.2.2 工藝優化及結果驗證 在其他試驗因素不變的情況下，考察A、B、C、D各試驗因素之間的交互項對得率的影響，結果如圖7所示。響應面圖坡度越陡表示響應值受該因素的影響越大[33]。在交互項對得率的影響中，當其他因素保持在零水平時，溶質質量分數的改變并不能顯著影響提取時間（AB）對得率的影響，反之也成立；液料比的改變也不能顯著影響到提取溫度（CD）對得率的影響，反之也成立。這說明溶質質量分數與提取時間、液料比與提取溫度之間的交互作用并不明顯，但其他因素之間交互作用顯著，這與方差分析結果一致。

圖 7 各因素之間交互作用對蒙花苷得率的影響Fig.7 Response surface graphs showing the effect of extraction conditions on the yield of buddleoside

通過響應面試驗優化得出最優提取條件為：回流溶質質量分數54.13%、提取時間60 min、液料比為150:1（mL/g）、提取溫度為80 ℃，得率預測值為2.80%。根據實際情況將最優處理條件中溶質質量分數由54.13%調整為54%，在此最優條件下進行3次水平實驗，平均得率為2.75%±0.03%，實際結果與預測結果相對誤差為1.82%（<5%），說明實際值與預測值之間無顯著差異。證明了該模型與實際情況擬合度高，能夠指導實際生產。

2.3 方法可行性分析

2.3.1 重復性實驗 精密稱取同一樣品野菊花干粉0.1 g，按上述最優工藝參數進行回流提取，提取液取6份供HPLC分析，蒙花苷得率經計算結果為2.75%±0.03%，表明重復性較好。

2.3.2 穩定性實驗 以最優工藝參數制作供試品溶液，置于室溫保存，分別于0、3、6、9、12 h進樣檢測，記錄蒙花苷色譜峰峰面積，通過色譜峰面積計算各樣品間的相對標準偏差，所得結果RSD=3.7615%（<5%），表明供試提取液在室溫下12 h內穩定。

2.3.3 加標回收率驗證 精密稱取0.1 g野菊花粉末置于三角燒瓶中，分別加入4、2、1 mg蒙花苷標準品。樣品在上述最優處理參數下進行回流提取，提取液經HPLC分析，計算其得率及加標回收率。結果如表4所示，不同濃度的3個水平樣品加標回收率均達到80%以上，證明該最優方案能夠有效地將樣品中的大部分蒙花苷提取出來，具有實際應用價值。

表 4 蒙花苷的加標回收結果Table 4 Results of standard recoveries of buddleoside

2.4 孝感市大悟縣不同地區野菊花蒙花苷含量測定

通過響應面試驗優化的最優實驗方案，對大悟縣不同區域實地取樣的野菊花樣本進行蒙花苷提取測定，具有代表性的野菊花提取液的高效液相色譜圖如圖8所示。

圖 8 蒙花苷的高效液相色譜圖Fig.8 Liquid chromatograms of buddleoside

表 5 大悟縣不同區域野菊花樣品中的蒙花苷含量結果Table 5 Content of buddleoside in C. indicum L. from different regions of Dawu County

各區域野菊花樣本中蒙花苷的提取測定結果如表5所示。由表5可知，不同區域的野菊花蒙花苷含量差異較為明顯，取樣地027、037、060、094蒙花苷含量最高，均超過了2.5%（分別為2.75%、2.54%、2.52%、2.51%），為野菊花積累蒙花苷的最優種植區域。此外，取樣點015、036、038、040、041、042、049、061、067、068、069、073、111野菊花樣品蒙花苷含量均達到了2.00%以上，為較優種植區域。

3 結論

本研究在單因素實驗分析的基礎上，通過Box-Behnken設計了響應面試驗，建立了野菊花蒙花苷成分提取的多元回歸模型，以此確定野菊花蒙花苷最優提取工藝條件為乙醇質量分數54%、液料比150:1（mL/g）、回流溫度80 ℃、回流提取時間60 min，在此工藝條件下，野菊花蒙花苷得率為2.75%±0.03%，與模型預測最大值2.80%無顯著性差異。且模型調整決定系數R2adj=0.9592，證明此優化方案可應用于實際生產。

在加標回收實驗中，3個不同濃度水平下的回收率均達到80%以上，結合穩定性實驗與重復性實驗，系統證明了該優化方案具有可行性。以優化方案測定孝感市大悟縣不同地區野菊花樣品蒙花苷含量，結果顯示：027、037、060、094號取樣地蒙花苷含量最高，均達到2.5%以上，為積累蒙花苷的最優種植區域，015、036、038、040、041、042、049、061、067、068、069、073、111號區域樣品蒙花苷含量達到了2.0%以上，為較優種植區域。本研究成果對大悟縣種植富含蒙花苷的野菊花具有重要指導意義，同時為該地區野菊花生產加工、蒙花苷提取工業化制備提供有力參考。