不同酪蛋白磷酸肽產品理化性質與持鈣能力的相關性分析

姜春秀，全 威，陳 潔，賀來健,

（1.貝親管理（上海）有限公司，上海 200030；2.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫 214122）

酪蛋白磷酸肽（Casein Phosphopeptide，CPP）是以牛乳酪蛋白為原料，經過酶水解、分離純化得到的一種含有磷酸絲氨酸簇的生物活性多肽，其相對分子質量為1000~5000 Da[1?2]。研究表明，酪蛋白磷酸肽中特殊的磷酸絲氨酸簇等核心結構具有螯合鈣等礦物離子的能力，特別是能在小腸中性或偏堿性的環境中與鈣離子鰲合成鈣鹽，從而抵抗消化道中各種消化酶的水解并阻止鈣離子形成磷酸鈣沉淀[3?4]。此外，酪蛋白還被證明能夠有效地增加鈣在體內的滯留時間，同時促進腸壁細胞對鈣離子的吸收和利用[5?6]。

鈣是人體中含量最豐富的礦物質元素，約占成年人體重的1.5%~2.0%左右[7]。而鈣缺乏會導致兒童生長發育不良、骨質疏松、佝僂病等情況的發生[8]。我國營養調查顯示，兒童、青少年、孕婦和老年人普遍存在缺鈣的現象[9]。酪蛋白磷酸肽作為一種良好促鈣吸收劑能夠有效地提高鈣的吸收利用率，從而預防佝僂病、齲齒、兒童發育不良等疾病[10?12]。我國目前已經逐步將酪蛋白磷酸肽作為營養強化劑應用于嬰幼兒奶粉、鈣強化乳制品、蛋白飲料和營養補充劑等[13?14]。

然而由于加工原料和制備方法的差異，不同酪蛋白磷酸肽組分性質差異較大。前人的研究表明酪蛋白磷酸肽產品的氨基酸組成和排序、水解度等對磷酸基結合鈣的能力會產生很大的影響[2,13,15]。因此，本研究對不同酪蛋白磷酸肽產品的性質進行分析，并通過體外模擬實驗考察這些酪蛋白磷酸肽產品在不同添加量劑量下的持鈣能力，基于主成分分析和相關性分析的方法研究不同酪蛋白磷酸肽產品特性影響其持鈣能力的關鍵因素，為酪蛋白磷酸肽在食品中更好的應用提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

7種市面上在售商業化酪蛋白磷酸肽產品 采購自7家不同的生物科技公司；乙腈、甲醇、甲酸色譜純，美國Tedia公司；異硫氰酸苯酯、正亮氨酸

天津博納艾爾杰有限公司；實驗室超純水 由美國MiLLipore公司純水凈化系統制備；無水乙醇、氯化鋇、三氟乙酸、鹽酸、三乙胺、醋酸鈉、冰醋酸 分析純，中國上海國藥化學試劑有限公司。

2695高效液相色譜串聯四極桿質譜、2690超高效液相色譜串聯四極桿質譜 美國Waters公司；3K15冷凍離心機 美國Sigma公司；AX205電子天平、FE20 pH計 瑞士Mettler Toledo公司；DHG-9070A鼓風干燥烘箱 中國常州金壇儀器有限公司；TDL-5-A型臺式離心機 中國上海安亭儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 CPP含量測定 根據文獻[1,16]：準確稱取5.0 g CPP樣品，加入40 mL超純水，充分攪拌振蕩使其溶解，用0.1 mol/L鹽酸將pH調至4.5并用超純水將體積定容至50 mL，室溫下靜置60 min。隨后將溶液在室溫條件下5000×g離心30 min收集上清液，同時將沉淀重復上述步驟處理。將以上步驟所得的上清液混合，并用超純水將體積定容至100 mL。接下來加入BaCl2，使其濃度達到50 mmol/L，充分攪拌后加入100 mL無水乙醇充分振蕩后置于4 ℃冰箱中靜置24 h，同樣的在室溫條件下5000×g離心30 min收集上清液。繼續向沉淀中加入100 mL 50%的乙醇（攪拌破碎沉淀），并且在室溫條件下5000×g離心30 min。重復該步驟攪拌離心兩次，將所得的沉淀在60 ℃的條件下減壓干燥24 h（真空度≤24 mm Hg）。最終稱量所得的沉淀質量并通過以下公式計算CPP含量：

式中：c：CPP含量，%；m1：干燥后的乙醇鋇沉淀的質量，g；m2：稱樣的質量，g。

1.2.2 CPP總氮、總磷含量及N/P（摩爾比）的計算根據GB 5009.5-2016《食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法測定[17]。CPP中總磷的含量采用X射線熒光儀測定。將CPP中總氮和總磷的含量通過公式計算得到N/P（摩爾比）[2,18]：

式中：n：N/P摩爾比；n1：N的質量百分含量，%；n2：P的質量百分含量，%；31：P的相對分子質量，g/mol；14：N的相對分子質量，g/mol。

1.2.3 CPP的氨基酸組成 根據文獻[19]，準確稱取一定量的CPP樣品（使樣品氨基酸總量在50~75 mg范圍內），置于15 mL水解管中，隨后加入10 mL 6 mol/L鹽酸，充分振搖使CPP樣品均勻分散于溶液中，同時充N23 min混勻密封。然后置110 ℃烘箱中水解24 h，取出冷卻后加入4.8 mL 10 mol/L NaOH中和水解液。之后將水解液全部轉移到50 mL容量瓶內，用超純水定容至刻度，混勻。定容后的樣液用雙層濾紙過濾，收集濾液在15000×g下離心15 min，取上清液供衍生使用。

準確量取樣品溶液或氨基酸混合標準品溶液200 μL，置于1.5 mL塑料離心管中，準確加入20 μL正亮氨酸內標溶液，三乙胺乙腈溶液100 μL，異硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL，充分振蕩混勻，室溫條件下靜置2 h，然后加入正己烷400 μL，充分振搖萃取后放置20 min，取下層溶液，用0.45 μm微孔濾膜過濾。

HPLC條件如下：色譜柱：Venusil-AA氨基酸分析專用柱（100 ?，4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長：254 nm；柱溫：40 ℃；流動相A：稱取15.2 g無水醋酸鈉，加水1850 mL，溶解后用冰醋酸調pH至6.5，然后加乙腈140 mL，混勻，用0.45 μm濾膜過濾。流動相B：80%（v/v）乙腈溶液，進樣量：10 μL。

1.2.4 CPP的分子量分布 根據文獻[2]，經過適當修改后用于測定CPP樣品的分子量分布情況。具體操作如下：配制濃度為10 mg/mL的CPP樣品，采用Waters高效液相色譜儀（配2487紫外檢測器），對酪蛋白磷酸肽的分子量分布進行測定。

HPLC條件如下：色譜柱：TSKgel2000 SWXL（300 mm×7.8 mm）；流動相：乙腈/水/三氟乙酸，45/55/0.1（v/v）；檢測波長：220 nm；流速：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

1.2.5 CPP的持鈣能力分析 根據文獻[2,15,20]并經過適當調整：由于鈣離子進入人體后易與人體內的磷酸根離子結合生成磷酸鈣沉淀，不能被人體吸收，而CPP具有螯合鈣離子、阻止生成磷酸鈣沉淀的作用，因此建立與人體溫（37 ℃）、小腸末端pH條件（pH=7.2）相同的模擬反應體系。向模擬反應體系中引入磷酸根離子和CPP，然后加入鈣離子，觀察CPP阻止磷酸鈣沉淀的效果并用pH-Stat法檢測。

具體實驗步驟如下：向酶反應器中加入適量NaH2PO4和CPP，使二者在模擬反應體系中的濃度分別為8 mmol/L和0.05、0.1、0.2 g/L。將模擬反應體系溶液加熱至37 ℃保溫后加入0.1 mol/L的CaCl2溶液，使模擬反應體系中 CaCl2的濃度為8 mmol/L，并且模擬反應體系中Ca:P（摩爾比）=1:1，其中P是由NaH2PO4所提供的以不同解離狀態存在的磷酸根中的磷。接下來立即用0.05 mol/L的NaOH溶液，在2 min內將反應體系的pH調節至7.2，并不斷滴加0.05 mol/L NaOH，使模擬反應體系的pH保持在7.2。從調節pH開始計時的第2 min開始，每隔5 min記錄一次0.05 mol/L NaOH的消耗量，持續1 h。以時間為橫坐標，0.05 mol/L NaOH的消耗量為縱坐標作圖。

圖 1 7種CPP樣品（添加量為0.05 g/L）阻止磷酸鈣沉淀形成效果Fig.1 Effect of 7 CPP samples（at 0.05 g/kg）on preventing calcium phosphate precipitation formation

圖 2 7種CPP樣品（添加量為0.1 g/L）阻止磷酸鈣沉淀形成效果Fig.2 Effect of 7 CPP samples（at 0.1 g/kg）on preventing calcium phosphate precipitation formation

圖 3 7種CPP樣品（添加量為0.2 g/L）阻止磷酸鈣沉淀形成效果Fig.3 Effect of 7 CPP samples（at 0.2 g/kg）on preventing calcium phosphate precipitation formation

1.3 數據處理

所有的實驗都重復三次，且實驗結果用平均值±標準偏差來表示。采用Stastistics（9.1版本）中的一般線性模型程序進行顯著性分析（P<0.05），并且使用最小顯著差異（LSD）法進行全配對多重比較。本研究還進一步采用瑞士Umetrics公司的SIMCA 13.0軟件進行主成分分析（Principle Component Analysis, PCA）對不同CPP產品的理化性質降維處理，比較不同CPP產品理化性質的差異。選取PCA中的主要貢獻因素并進一步通過SPSS 19.0軟件中的Pearson線性關系模型對CPP產品理化性質和其持鈣能力的強弱相關性進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同產品的CPP含量

本研究測定了7種樣品中CPP的含量，結果見表1。結果表明不同樣品之間CPP含量存在明顯差異，4號樣品中CPP含量最高為18.50%（P<0.05），其次是3號和6號樣品，2號和5號樣品中CPP含量較低，僅有7%~8%左右，而CPP含量最低的是7號樣品，僅為1.30%左右。

表 1 乙醇鋇沉淀法測定的樣品中CPP含量Table 1 CPP content in different samples determined by barium ethanol precipitation method

2.2 不同產品中總氮、總磷含量及N/P比

從表2的結果來看，除7號樣品之外不同CPP樣品中氮元素含量差異不大，所有樣品中1號樣品磷元素含量最高。N/P是評價CPP質量的一個重要指標，N/P>24為高N/P CPP，15~24為中N/P CPP，而<15為低N/P CPP[2,21]。本研究中7種樣品除1號和7號樣品外均為高N/P CPP，且6號CPP樣品N/P最高，其次是2號和5號樣品。

2.3 不同產品中氨基酸組成及含量

本研究采用酸水解和PITC衍生法對7種CPP樣品進行了前處理，并用HPLC結合氨基酸分析專用液相色譜柱測定了7種CPP樣品中氨基酸的組成和含量，結果如表3所示。從總氨基酸含量結果來看，2號樣品中總氨基酸含量最高，7號樣品中總氨基酸含量顯著低于其它樣品（P<0.05），而其它各樣品中總氨基酸含量差異不明顯。比較各樣品中氨基酸組成來看，各CPP樣品中谷氨酸含量較高，其次還含有一定量的亮氨酸和異亮氨酸，這與文獻結果相似[2,21?23]。表3結果還顯示，7種樣品中脯氨酸含量均最高，且顯著高于其他種類氨基酸（P<0.05），這與徐曼和王青華等測定的自制CPP以及商業CPP的氨基酸組成結果存在明顯差異[15,22]。文獻中報道的CPP中脯氨酸的含量在30~90 mg/g之間[15,22]，本研究中除7號CPP樣品之外，其它樣品的脯氨酸含量為168.00~369.00 mg/g。參考文獻報道的結果來看[24?26]，一般牛乳中氨基酸含量最高的是谷氨酸，脯氨酸含量一般在100 mg/g左右，推測本研究中所購買的7種商品化CPP產品脯氨酸含量較高可能與原料選擇以及制備方法有關。

表 2 CPP中N、P含量及比值Table 2 N and P content and ratio in CPP

表 3 CPP中氨基酸組成及含量（mg/g）Table 3 Composition and content of amino acid in CPP(mg/g)

2.4 不同產品中CPP的分子量分布

本研究采用HPLC法對7種樣品的分子量分布情況進行了分析測定，結果如表4所示。1~6號CPP樣品的分子量主要集中在5000 Da以下，如3和4號樣品分子量80%以上集中在1000 Da以下，2和5號樣品中約80%樣品分子量集中在5000 Da以下，這與文獻的CPP分子量結果基本相符[2,21?22,27]。而7號CPP樣品分子量僅有20%左右小于5000 Da，一般認為酪蛋白磷酸肽的分子量在5000 Da以下，7號樣品分子量僅有20%左右小于5000 Da也與前面測定發現的7號樣品CPP含量較低相符合。

表 4 CPP中分子量分布（%）Table 4 Molecular weight distribution in CPP(%)

2.5 不同CPP樣品在不同添加量條件下的持鈣能力

本研究比較不同CPP樣品在不同添加量情況下的持鈣能力，結果如圖1~圖3所示。從磷酸鈣沉淀形成的時間來看，1~7號CPP樣品按照0.05、0.1和0.2 g/L加入模擬反應體系后磷酸鈣沉淀開始生成的時間大約都在5~15 min左右，不同CPP樣品對于磷酸鈣沉淀生成的時間沒有明顯影響，整體上7種CPP樣品的持鈣能力呈現出隨著添加量的增加而增強趨勢。比較不同CPP樣品在添加量為0.05、0.1和0.2 g/L時的持鈣能力結果來看，1、2和6 號樣品中NaOH的消耗量最少，表明這三種CPP樣品在三種添加量條件下的持鈣能力均較強，其次是4號CPP樣品，3號和5號CPP樣品的持鈣能力略差于前面四種樣品，7號CPP樣品持鈣能力極差。結合之前對7種CPP樣品的幾項指標測試結果來看，7號樣品的CPP含量最低，且大多為分子量高于10000 Da的大分子，同時N/P最低，這些可能都是造成7號CPP樣品持鈣能力明顯弱于其它樣品的原因[2,15]。而比較其它樣品來看，6號CPP樣品N/P最高，且CPP含量為15.20%；2號CPP樣品雖然CPP含量不高，但氨基酸含量明顯高于其它樣品；4號樣品CPP含量最高，且分子量分布主要集中在1000 Da以內，這些CPP樣品以不同添加量加入模擬反應體系中的持鈣能力有明顯的差異。因此，CPP產品性質與持鈣能力的關聯還需要進一步分析。

2.6 CPP樣品性質與持鈣能力的主成分分析及相關性分析

根據CPP產品理化性質的分析結果以及不同添加量情況下的持鈣能力研究結果來看，不同CPP產品的理化性質存在明顯差異，并且持鈣能力同樣存在明差異。但其中的信息復雜重疊，大量的結果造成了分析的困難。因此，本研究采用主成分分析的方法，對CPP的氨基酸組成及含量、分子量分布情況、N/P比、CPP含量以及持鈣能力的結果進行篩選分析，能夠剔除不重要的信息，消除指標間的重疊性，從而簡化分析過程[28?29]。

主成分分析的得分圖和載荷圖見圖5和圖6，由得分圖可知前兩個主成分的累計貢獻率為84.1%（R1=0.674，R2=0.167），其中主成分1代表數據集中所有變量的67.4%的信息，能夠在很大程度上反映數據集的信息，主成分2代表16.7%，兩個主成分的累積貢獻率大于80%，能夠很好地代表所有變量的信息[28?29]。載荷圖反映了由主成分1和主成分2構成的線性方程的系數的結果，載荷的絕對值越大，該因素對主成分的影響就越大，這個影響在圖中通過載荷代表的點到原點的距離來反映。如果載荷離原點較遠，表示這個因素對樣品間的差異存在顯著的貢獻[30]。由載荷圖可知，對主成分1有顯著貢獻的指標為大多數氨基酸的含量、分子量>10000 Da的組分比例以及持鈣能力的結果。對主成分2有顯著貢獻的指標為分子量在5000~10000 Da以及<1000 Da的組分比例、天冬氨酸含量、賴氨酸含量和CPP含量。結合主成分得分圖和載荷圖，可以描述CPP樣品性質特征與持鈣能力之間的關聯。在得分圖中（圖5），7號CPP樣品分布在得分圖的左下側區域，結合載荷圖（圖6）分布結果來看，7號CPP樣品分子量大于10000 Da的比例最高且賴氨酸含量較高，而7號CPP樣品在不同添加量條件下持鈣能力測試中氫氧化鈉消耗量較高，表明持鈣能力較差。2號CPP樣品分布在得分圖的右下側區域，結合載荷圖分布結果來看，2號CPP樣品除賴氨酸之外的其它氨基酸的含量較高，同時持鈣能力較強。其余CPP樣品主要分布在得分圖的中間區域，其中3號和4號樣品分布在得分圖的上側區域，結合載荷圖分布結果來看。這些樣品的CPP含量以及分子量小于1000 Da的組分含量明顯高于其它樣品，同時持鈣能力要強于7號樣品。從主成分分析的結果來看，分子量大于10000 Da的組分含量較高以及賴氨酸含量較高的樣品持鈣能力較差。而苯丙氨酸、異亮氨酸、纈氨酸等氨基酸的含量較高，分子量小于1000和1000~5000 Da組分的含量以及CPP含量較高的CPP樣品持鈣能力較強。同時，結果提示這些主成分分析中的主要貢獻因素包括分子量分布、氨基酸含量以及CPP含量與CPP樣品的持鈣能力強弱存在一定關聯。

圖 5 7種CPP樣品的主成分分析得分圖Fig.5 Principal component analysis score plots for the 7 CPP samples

圖 6 7種CPP樣品的主成分分析載荷圖Fig.6 Principal component analysis loadings for 7 CPP samples

因此，為了進一步分析CPP樣品性質與持鈣能力強弱的關聯，基于主成分分析的結果，本研究選擇了第一主成分和第二主成分中主要貢獻因素包括：丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸，分子量分布情況（>10 kDa，0.5~10 kDa，0.1~0.5 kDa以及<0.1 kDa的比例）以及CPP的含量與CPP的持鈣能力進一步進行了相關性分析。結果如表5所示，在不同的CPP添加量條件下，CPP樣品中分子量分布>10 kDa的組分比例與持鈣能力均呈現極顯著的負相關性（P<0.01），即CPP樣品分子量>10 kDa的比例越高，持鈣能力越差。除此之外，當CPP的添加量為0.1和0.2 g/L時，還發現CPP樣品中異亮氨酸和苯丙氨酸的含量與持鈣能力表現出顯著的正相關性（P<0.05）。相關性分析結果表明，對于不同CPP樣品來說分子量>10 kDa的組分比例越高，其持鈣能力越差。而對于分子量分布結果相似的CPP樣品來說，其異亮氨酸和苯丙氨酸含量越高，其持鈣能力更好。目前對于CPP產品理化性質與持鈣能力的研究結果主要發現CPP產品水解度、純度越高，其持鈣能力越強[2,15,27]。本研究發現了CPP產品分子量小的組分比例越高，其持鈣能力越強，CPP產品分子量小的組分比例高，從本質上來看其實也就反映了CPP產品的水解度和純度越高。另外，還有研究發現CPP產品的磷酸基密度對持鈣能力也有顯著影響，而CPP產品的氨基酸組成和排序對其磷酸基密度起到關鍵影響[2,13,18]，但相關研究并沒有具體指出哪些氨基酸對持鈣能力起到了顯著影響，本研究結果則發現了異亮氨酸和苯丙氨酸含量較高的CPP產品其持鈣能力更好。

3 結論

本研究對市場上常見的7種酪蛋白磷酸肽產品的CPP含量、氮磷比、分子量分布、氨基酸組成等主要性質進行了分析測定，同時采用模擬反應體系對7種酪蛋白磷酸肽產品在不同添加量（0.05、0.1、0.2 g/L）情況下的持鈣能力進行了分析比較，發現不同產品的性質和持鈣能力存在顯著的差異。通過主成分分析和相關性分析發現CPP樣品中分子量>10 kDa的組分比例與CPP持鈣能力強弱呈極顯著的負相關性（P<0.01）。而CPP中異亮氨酸和苯丙氨酸的含量與持鈣能力表現出顯著的正相關性（P<0.05）。研究結果表明，從提高酪蛋白磷酸肽產品持鈣能力的角度上考慮，在制備酪蛋白磷酸肽的工藝過程中，應該選擇合適的水解途徑或水解酶，將酪蛋白磷酸肽產品的分子量盡量控制在10 kDa以下，并適當提高產品異亮氨酸和苯丙氨酸的含量。而從使用酪蛋白磷酸肽產品的角度考慮，也應該重點關注酪蛋白磷酸肽產品的分子量分布（>10 kDa的含量）和異亮氨酸及苯丙氨酸的含量水平，以保證酪蛋白磷酸肽產品能夠發揮穩定持鈣能力。本文從不同CPP產品的主要性質和持鈣能力入手，通過主成分分析和相關性分析的方法，探究CPP原料性質與其持鈣能力的關聯，為提高以及評價CPP產品質量提供了一定的參考依據。

表 5 CPP樣品特性與持鈣能力的相關性分析Table 5 Correlation analysis of CPP sample characteristics and calcium-holding capacity